大豆疫霉根腐病抗性相关基因EIN3--1、EIN3--2的克隆及功能初步研究

摘要

大豆疫霉菌是大豆疫霉根腐病的来源，它能够在全世界范围里破坏大豆的生长。它对大豆减产，危害很明显，是一种最具破坏性的疾病。大豆疫霉根腐病在我国病发的面积呈每年都扩大的趋势，严重的危害了我国大豆种植和生产。 抗病品种的选择是最经济有效的措施，但由于大豆疫霉菌的致病力分化的复杂特性，生理变化快，容易导致丧失抗性，所以，相关抗性基因的挖掘，并且对基因进行研究，能为解决抗性基因工程问题的方法的理论基础。 EIN3转录因子属于一个小的转录因子家族，在拟南芥、烟草、番茄和水稻中均有提高抗病性的报道。本课题组在使用高抗1号生理小种的大豆品种“绥农10”为实验材料建立的基因库中选择了两条EST序列。本研究利用RT-PCR技术从“绥农10”中分离出基因全长序列，是大豆中的新基因，命名为GmEIN3-1、GmEIN3-2。通过对基因进行定量分析、亚细胞定位的观察、两个基因转入烟草和大豆、转基因植株离体的叶片进行抗病性鉴别等方法对两个基因进行了研究，研究成果如下: 1.利用RT-PCR技术从“绥农10”中分离出GmEIN3-1基因全长序列(GenBank accessionno XM_003519439.2)。EIN3-1基因的cDNA全序列为2486bp，ORF为1845bp，编码614个氨基酸，该基因在297核苷酸处有一个起始密码子ATG，2139处有一个终止密码子TGA。利用在线预测软件得出:EIN3-1编码的氨基酸中从168到305有一个保守的结构域，三级结构预测得出，在编码的氨基酸中有3个核定位信号。 2.利用RT-PCR技术从“绥农10”中分离出GmEIN3-2基因全长序列(GenBank accessionno XM_003545435.2)。EIN3-2基因的cDNA全序列为2576bp，ORF为1833bp，编码610个氨基酸，该基因在420核苷酸处有一个起始密码子ATG，2250处有一个终止密码子TGA。利用在线预测软件得出:EIN3-2编码的氨基酸中从168到305有一个保守的结构域，三级结构预测得出，在编码的氨基酸中有2个核定位信号。 3.“绥农10”接种大豆疫霉菌，喷施乙烯、脱落酸和赤霉素，荧光定量PCR表明:EIN3-1、EIN3-2基因的表达受乙烯、疫霉菌、赤霉素和脱落酸诱导，其中受乙烯和疫霉菌诱导明显。 4.构建了pCAMBIA1302-EIN3-2GFP融合表达的载体，利用基因枪法转入洋葱表皮可看出: EIN3-2基因编码蛋白定位在细胞核内。 5.构筑了pCAMBIA3301-EIN3-1和pCAMBIA3301-EIN3-2的植物过表达载体，使用农杆菌介导的方法转化到烟草之中，经过PCR的鉴别，得出EIN3-1在T0代得到了转入基因的植株有6个，EIN3-2基因有11个。把阳性的植株的叶片切下来，在体外进行接种烟草疫霉菌，通过5天的试验可以看出来，转基因的烟草的叶片比非转基因的叶片抗病。 6.本实验的外植体为感病的大豆品种“东农50”的子叶进行大豆的遗传和转化。获得转EIN3-1T2代阳性植株20株，转EIN3-2 T3代阳性植株6株，Southern杂交表现阳性1株。用离体叶片接种大豆疫霉菌1号生理小种，结果显示转基因植株的抗病性比对照增强。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 关于大豆疫霉根腐病

1．1．1 大豆疫霉根腐病的情况和它在世界上的危害

1．1．2 大豆疫霉菌基本情况的研究

1．1．3 有关大豆疫霉菌致病性的相关研究

1．1．4 大豆疫霉根腐病抗病基因的寻找以及研究

1．1．5 大豆疫霉根腐病的抗病育种研究

1．2 乙烯循环的研究进展

1．3 EIN3基因的研究进展

1．3．1 EIN3基因的结构

1．3．2 EIN3转录因子的功能

1．4 研究的目的及意义

1．5 技术路线

2 材料与方法

2．1 实验材料及试剂

2．1．1 品种和菌种

2．1．2 菌种和载体

2．1．3 主要试剂

2．2 实验方法

2．2．1 材料的培养与处理

2．2．2 大豆总RNA的提取集cDNA的合成

2．2．3．1 大豆总RNA的提取

2．2．4 EIN3-1、EIN3-2全长cDNA序列的获得及生物信息学分析

2．2．5 对EIN3基因进行克隆

2．2．6 EIN3基因表达模式分析

2．2．7 EIN3-1、EIN3-2基因基因的亚细胞定位观察

2．2．8 植物表达载体的构建

2．2．7 烟草遗传转化及功能分析

3 结果与分析

3．1 大豆总RNA的提取

3．2 EIN3基因序列的生物信息学分析

3．2．1 EIN3-1、EIN3-2基因编码蛋白质性质和功能分析

3．2．2 EIN3-1基因与EIN3-2和其它物种的同源性分析

3．3 EIN3-1、EIN3-2基因表达模式分析

3．3．1 EIN3-1、EIN3-2基因在不同激素处理条件下表达分析

3．4 EIN3-7、EIN3-2基因的亚细胞定位研究

3．4．1 目的基因的PCR扩增

3．4．2 重组表达载体的构建

3．4．3 荧光显微镜观察洋葱表皮

3．5 植物过量表达载体pCAMBIA3301-EIN3的构建

3．5．1 pCAMBIA3301-EIN3-1、pCAMBIA3301-EIN3-2重组载体的构建

3．5．2 重组载体转化农杆菌

3．6 烟草的遗传转化及功能分析

3．6．1 烟草的遗传转化

3．6．2 转基因烟草的PCR检测

3．6．3 转基因烟草的抗性鉴定

3．7 大豆的遗传转化及相关功能分析

3．7．1 利用子叶节法进行大豆的遗传转化

3．7．2 T1代转基因植株的PCR检测

3．7．3 转基因大豆的Southern杂交检测

3．7．4 离体叶片接种法鉴定T1代转基因大豆的抗病性

4 讨论

4．1 EIN3基因的研究

4．2 乙烯循环与植物胁迫反应

4．3 EIN3-1基因与EIN3-2基因的比较

4．4 关于后续工作

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文