温度、高效氯氰菊酯对东亚小花蝽(Orius sauteri)捕食功能及体内HSPs的表达水平影响

摘要

东亚小花蝽（Orius sauteri）是田间重要的捕食性天敌昆虫之一，本研究室多年监测大豆田天敌昆虫发生情况的结果表明，在东北地区，小花蝽具有发生早、田间控制害虫时间长的特点，是早期控制蓟马、蚜虫的主要天敌，是一类很有利用价值的天敌昆虫。目前，我国在农事操作、田间管理过程中，由于化学农药的施用，大大影响了小花蝽固有的的生物防治效果。为了更好的减少农药的使用，降低环境危害，本文着重研究了田间外界因素对东亚小花蝽的捕食功能与体内抗逆蛋白表达水平的影响，为更好的利用天敌昆虫进行生态农业提供参考。
　　本研究选取东亚小花蝽成虫为供试材料，对其于不同温度、不同农药梯度下捕食量情况、种内竞争捕食功能参数等进行分析研究，并通过提取虫体总RNA、利用RT-PCR和RACE技术，克隆得到热休克蛋白基因hsc70、hsp70、hsp90基因全长，经原核表达及Western-blot验证了克隆基因的正确后，采用Real-time PCR技术，分析了在不同温度(10℃、18℃、26℃、34℃、42℃)下、不同高效氯氰菊酯浓度(CK、LC25、LC50、 LC75)下，及这两种因子共同胁迫作用下，对东亚小花蝽体内hsc70、hsp70、hsp90的表达量水平影响。通过试验分析确定了东亚小花蝽最适捕食温度为26℃，东亚小花蝽成虫处理一头大豆蚜所需的时间(Th)以26℃时最短(0.0549 d)，18℃时最长(0.1155 d);捕食上限以26℃时最大（18.2头），18℃时最小（8.65头）;瞬间攻击率(a)以26℃时最大(1.3122)，34℃时最小(0.6160)。在供试农药浓度梯度范围内，东亚小花蝽成虫处理一头大豆蚜所需的时间(Th)以0 mg/L时最短(0.0549d)，140 mg/L时最长(0.15 d)，其中在农药梯度在40 mg/L下时，处理一头大豆蚜所需的时间(Th)为0.0824 d，是0mg/L的1.5倍;捕食上限40 mg/L下为12.1359，约是0mg/L的2/3，且随着农药浓度的增加捕食上限也大幅度下降;农药胁迫下，40 mg/L下为0.3845，约是0 mg/L的2/7，且随着农药浓度的增加瞬间攻击率(a)也大幅度下降。
　　本研究获得了hsc70、hsp70、hsp90基因全长分别2207 bp、2286 bp、2433 bp，GeneBank登录号分别为:KJ573768、KJ867518、KJ573769。预测分子量为71.57 KDa、69.82 KDa、83.05KDa，与SDS-PAGE及Western-blot所得结果相吻合。Real-time PCR结果表明，在供试温度梯度下，hsc70表达量显著升高，分别是26℃的7～23倍，其各处理之间差异显著(P＜0.05);hsp70表达量也显著升高，最高可达到26℃的38.69倍。当温度升高或降低波动较范围较小时，东亚小花蝽体内hsc70、hsp90表达量上调倍数比hsp70表达量大，而当环境温度升高或降低波动剧烈时，其体内的hsp70表达量比hsc70、hsp90更容易被诱导升高，表现为hsp70表达水平是26℃下的30～40倍。在供试农药处理梯度下，以LC25浓度处理虫体与对照组相比较，hsc70大量表达，而hsp90表达量下降;10℃，42℃下，农药处理抑制的hsp70转录，表达量水平下降;随着农药浓度的增加hsp70、hsp90表达量显著升高，而hsc70表达量下降。本试验结果说明东亚小花蝽对一定温度范围内对高温、低温具有抗逆性，然而农药的施用会降低其体内抗逆蛋白HSPs的表达，从而降低了对不良自然环境的适应，影响其正常的生物防治效果。因此，利用捕食性天敌东亚小花蝽在进行田间释放、生物防治的过程中，应避免或降低农药的施用，从而达到利用天敌昆虫应有的生物防治效果，使农产品具有更高的经济价值。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 东亚小花蝽的研究现状

1．2 HSPs的研究概况

1．2．1 HSPs的研究背景

1．2．2 HSPs的表达调控

1．2．3 HSPs蛋白的结构特性

1．2．4 HSPs与昆虫的生长发育

1．2．5 HSPs与昆虫耐热性的关系

1．2．6 昆虫在化学农药胁迫下的研究进展

1．3 本实验研究目的及意义

2 材料与方法

2．1 虫源及饲养方法

2．2 主要的试剂及仪器

2．3 东亚小花蝽在胁迫下捕食功能试验方法及数据处理

2．3．1 东亚小花蝽不同温度下生物学状态观察与鉴定

2．3．2 不同温度下，东亚小花蝽成虫对大豆蚜成虫的捕食功能反应

2．3．3 不同温度下，东亚小花蝽成虫捕食大豆蚜的种内干扰

2．3．4 30％高效氯氰菊酯对东亚小花蝽成虫的毒力试验

2．3．5 不同浓度高氯下，东亚小花蝽对大豆蚜成虫的捕食功能反应

2．3．6 高氯处理下，东亚小花蝽成虫捕食大豆蚜的种内干扰

2．3．7 数据处理

2．4 东亚小花蝽hsc70、hsp70、hsp90基因全长的克隆

2．4．1 总RNA的提取

2．4．2 第一链cDNA的合成

2．4．3 hsc70、hsp70和hsp90基因片段的克隆

2．4．4．hsc70、hsp70、hsp90的5’RACE cDNA的获得

2．4．5 hsc70、hsp70和hsp90基因3’RACE及5’RACE的克隆及全长的获得

2．5 hsc70、hsp70和hsp90基因的原核表达

2．5．1 hsc70、hsp70和hsp90 cDNA序列ORF的扩增

2．5．2 原核表达载体的构建

2．5．3 蛋白的诱导表达与检测

2．5．4 Western blot分析

2．6 hsc70、hsp70、hsp90基因胁迫条件下表达分析

2．6．1 东亚小花蝽于不同温度下的胁迫处理

2．6．2 东亚小花蝽于不同高效氯氰菊酯浓度下的胁迫处理

2．6．3 东亚小花蝽于温度、高氯双因子胁迫下的胁迫处理

2．6．4 总RNA的提取

2．6．5 cDNA第一条链的合成

2．6．6 荧光定量PCR引物的设计

2．6．7 定量PCR引物特异性检测

2．6．8 定量片段的确认

2．6．9 荧光定量PCR

2．6．10 数据处理

3 结果与分析

3．1 东亚小花蝽成虫不同温度下对大豆蚜的捕食功能

3．1．1 东亚小花蝽成虫对大豆蚜捕食功能反应

3．1．2 东亚小花蝽成虫对大豆蚜寻找效应

3．1．3 东亚小花蝽成虫对大豆蚜捕食作用的种内干扰

3．1．4 温度对东亚小花蝽成虫捕食大豆蚜的影响

3．2 东亚小花蝽成虫在高氯不同梯度胁迫下对大豆蚜的捕食功能

3．2．1 30％高效氯氰菊酯对东亚小花蝽成虫的毒力试验

3．2．2 东亚小花蝽成虫在农药胁迫下对大豆蚜捕食功能反应

3．2．3 东亚小花蝽成虫在农药胁迫下对大豆蚜寻找效应

3．2．4 东亚小花蝽成虫农药胁迫下对大豆蚜捕食作用的种内干扰

3．2．5 农药胁迫对东亚小花蝽成虫捕食大豆蚜的影响

3．3 东亚小花蝽hsc70、hsp70、hsp90基因的克隆

3．3．1 hsc70、hsp70和hsp90 cDNA序列片段PCR扩增结果

3．3．2 hsc70、hsp70、hsp90基因3’RACE和5’RACE实验结果

3．3．3 hsc70、hsp70、hsp90基因cDNA序列全长

3．4 东亚小花蝽hsc70、hsp70、hsp90基因序列分析

3．4．1 东亚小花蝽hsc70基因序列分析

3．4．2 东亚小花蝽hsp70基因序列分析

3．4．3 东亚小花蝽hsp90基因序列分析

3．5 hsc70、hsp70和hsp90基因的原核表达

3．5．1 hsc70、hsp70和hsp90重组质粒的构建

3．5．2 hsc70、hsp70和hsp90重组质粒的诱导表达

3．5．3 hsc70、hsp70和hsp90重组蛋白的Western blot验证

3．6 hsc70、hsp70和hsp90基因胁迫表达模式

3．6．1 荧光定量分析特异引物的确定

3．6．2 高温胁迫下东亚小花蝽hsc70、hsp70和hsp90基因的表达变化

3．6．3 温度、高氯双因子胁迫下hsc70、hsp70和hsp90的表达变化

4 讨论

4．1 东亚小花蝽对大豆蚜的捕食效果评价

4．2 hsc70、hsp70和hsp90基因的克隆及分析

4．3 不同温度下hsc70、hsp70和hsp90基因表达水平分析

4．4 温度、高氯胁迫下hsc70、hsp70和hsp90基因表达水平

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文