硒通过线粒体途径对镉诱导的鸡脾脏淋巴细胞凋亡影响的研究

摘要

镉是一种存在于土壤、水和食物中的重要环境污染物。由于其在环境中的污染问题越来越严重，甚至可能威胁环境生态系统，而且它对禽类造成的危害也越来越显著，因此镉对自然界以及人们的生产生活所造成的影响应该引起人们的高度重视。硒，一种重要的营养微量元素，在甲状腺素代谢方面、氧化还原反应、生殖、以及免疫功能等方面都具有一定作用。它能够拮抗某些金属元素的毒性，其中也包括重金属镉，硒能够降低因外界刺激所导致的ROS的过量产生，对自由基的损伤也具有一定的保护作用，最终起到维持细胞的正常功能的作用。本课题主要集中在调查硒颉颃镉对体外鸟类免疫细胞的毒性影响，在鸡脾脏淋巴细胞中分别加入终浓度为10-6mol/L的氯化镉溶液进行染镉处理，终浓度为10-7mol/L的亚硒酸钠溶液以及同时加入10-6mol/L的氯化镉和10-7mol/L的亚硒酸钠的混合溶液进行体外培养试验。通过对鸡脾脏淋巴细胞凋亡形态变化、抗氧化功能、线粒体膜电位及细胞内Bak、p53、Caspase-3、Caspase-9、Cytc、bcl-2和bcl-xl的mRNA表达水平的检测，最终明确了从线粒体途径硒颉颃镉致鸡脾脏淋巴细胞凋亡影响的机制。研究结果表明:
　　1.通过荧光定量PCR技术检测鸡脾脏淋巴细胞凋亡相关基因，结果揭示了镉能够干扰禽类免疫细胞内Bak、p53、Caspase-3、Caspase-9、Cyt c、bcl-2等凋亡相关基因的mRNA表达，进而诱导细胞凋亡。镉引起鸡脾脏淋巴细胞中凋亡相关基因mRNA表达量在硒的作用下发生改变，硒减轻了镉诱导的脾脏细胞的凋亡。
　　2.通过对鸡脾脏淋巴细胞内NO、MDA含量及GSH-Px、iNOS、SOD与CAT活性的检测，在镉的作用下引发鸡脾脏淋巴细胞发生氧化胁迫，加硒后可减轻镉暴露后免疫细胞的氧化应激作用，表明镉对禽类免疫细胞抗氧化方面的损伤能够被硒所颉颃，发挥了硒元素在抗氧化方面的保护作用，减少镉对鸡脾脏淋巴细胞的毒性作用。
　　3.通过采用流式细胞术与荧光染色的方法分别检测了鸡脾脏淋巴细胞经镉处理后凋亡发生的情况，从生化改变和形态学角度均体现了镉诱导鸡脾脏淋巴细胞的凋亡。加硒后表明在很多方面，硒能减少镉对鸡脾脏淋巴细胞的毒性损伤作用。
　　总结，与镉单独处理组相比较而言，硒显著提高抗氧化酶的活性，降低MDA、ROS水平，此外，硒补充恢复了线粒体膜电位和钙离子水平，因为在硒的作用下线粒体功能的恢复并且硒能够改变凋亡相关基因（Bak、p53、Caspase-3、Caspase-9和Cyt c）的表达。总体说来，硒处理降低了镉诱导的形态学改变、氧化应激、离子紊乱及细胞凋亡，表明镉在鸡脾脏淋巴细胞的毒性能够被硒部分改变。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 镉的研究概述及其对免疫器官的影响

1．2 镉的毒理机制及硒的颉颃作用概述

1．3 细胞凋亡的概述

1．4 线粒体与细胞凋亡

1．5 细胞凋亡的检测方法

1．6 研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 鸡脾淋巴细胞悬液的制备、培养和处理

2．2 试验主要仪器和试剂

2．2．1 主要仪器

2．2．2 主要试剂

2．3 检测项目与试验方法

2．3．1 鸡脾脏淋巴细胞中凋亡相关基因mRNA表达的检测

2．3．2 鸡脾脏淋巴细胞内一氧化氮代谢的检测

2．3．3 鸡脾脏淋巴细胞氧化应激指标的检测

2．3．4 蛋白浓度的测定

2．3．5 测量细胞内ROS的产生

2．3．6 钙离子浓度测定试验

2．3．7 原位末端标记法检测细胞凋亡的检测

2．3．8 吖啶橙-溴化乙锭(AO／EB)双荧光染色法检测细胞凋亡

2．3．9 流式细胞仪检测线粒体膜电位(Δ Ψm)

2．4 试验数据分析与统计

3 结果与分析

3．1 硒颉颃镉导致鸡脾脏淋巴细胞中凋亡相关基因的mRNA表达影响的检测结果

3．2 鸡脾脏淋巴细胞内NO代谢影响的检测结果

3．2．1 鸡脾脏淋巴细胞内NO含量的影响

3．2．2 鸡脾脏淋巴细胞内iNOS活性的影响

3．3 鸡脾脏淋巴细胞内抗氧化功能的检测结果

3．4 鸡脾脏淋巴细胞内ROS的检测结果

3．5 鸡脾脏淋巴细胞钙离子浓度的检测结果

3．6 鸡脾脏淋巴细胞凋亡的形态学检测结果

3．6．1 鸡脾脏淋巴细胞内AO／EB双荧光染色检测结果

3．6．2 TUNEL检测结果

3．7 鸡脾脏淋巴细胞线粒体膜电位(ΔΨm)的检测结果

4 讨论

4．1 硒颉颃镉对鸡脾脏淋巴细胞凋亡的影响

4．2 镉对鸡脾脏淋巴细胞内NO代谢的影响及硒的颉颃作用

4．3 硒颉颃镉对鸡脾脏淋巴细胞内抗氧化功能的影响

4．3．1 硒颉颃镉对鸡脾脏淋巴细胞MDA含量的影响

4．3．2 硒颉颃镉对鸡脾脏淋巴细胞内抗氧化酶活性的影响

4．4 硒颉颃镉对鸡脾脏淋巴细胞形态学的影响

4．4．1 AO／EB双荧光染色法观察镉致鸡脾脏淋巴细胞形态学变化以及硒的颉颃作用

4．4．2 TUNEL法检测镉致鸡脾脏淋巴细胞DNA损伤的影响以及硒的颉颃作用

4．5 镉对鸡脾脏淋巴细胞内[Ca2+]i和CaM mRNA表达的影响以及硒的颉颃作用

4．6 镉对鸡脾脏淋巴细胞内bcl-2、bcl-xl、Bak、p53、Caspase-3和Caspase-9 mRNA表达的影响以及硒的颉颃作用

4．6．1 镉对鸡脾脏淋巴细胞内bcl-2、Bak、Bcl-xl、Caspase-3和Caspase-9 mRNA表达的影响以及硒的颉颃作用

4．6．2 镉对鸡脾脏淋巴细胞内p53 mRNA表达的影响以及硒的颉颃作用

4．7 硒颉颃镉对鸡脾脏淋巴细胞内ΔΨm和ROS生成以及Cyt cmRNA表达变化的影响

4．8 总结

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文