龙湾火山湖放线菌的分离鉴定及活性代谢产物研究

摘要

放线菌次级代谢产物丰富，作为微生物天然药物的一项重要来源，其资源的开发与利用一直以来备受科研人员们的广泛关注。随着人类社会的发展，人们对高活性、新构型天然药物的需求愈加强烈，然而，伴随常规生态系统中放线菌资源研究的深入，获得新型天然药物产生菌的难度愈来愈大，这极大地影响了新药的开发效率。因此，寻找新的分离源，从特殊生境中分离放线菌是提高新型天然药物产生菌分离效率的有效途径。三角龙湾火山湖，坐落于中国吉林省辉南县，由20万年前火山喷发后地下水上升聚集而成的火山口湖，以其独特的地貌特征形成了特异的生态系统，为丰富放线菌物种资源，发掘新型天然化合物提供了新的分离来源。因此，本研究以龙湾火山湖土壤沉积物为分离对象，对其进行放线菌的分离、多相鉴定、物种组成分析以及拈抗菌株活性产物研究。研究结果如下:
　　(1)分离获得火山湖放线菌158株。通过培养和形态特征观察后对菌株进行初步归类。选择形态特征具有代表性的菌株进行16S rRNA基因测序。经过EzTaxon服务器在线分析与典型菌株的序列进行相似性比对，确定菌株的归属。分析结果显示，火山湖放线菌分布于放线菌目的8个属内:链霉菌属（Streptomyces，76％），小单孢菌属（Micromonospora，14％），野野村氏菌属，（Nonomuraea，4％），游动放线菌属（Actinoplanes，2％），小链孢菌属（Catellatospora，1％），地嗜皮菌属（Geodermatophilus，1％），拟诺卡氏属(Nocardiopsis,1％)，红球菌属（Rhodococcus，1％）。对候选新种放线菌进行评估分析，通过多相分类学鉴定了3株放线菌(NEAU-C3、NEAU-JM1和NEAU-JM2)为新种放线菌。
　　(2)菌株NEAU-C3的多相分类学鉴定:16S rRNA基因测序结果分析显示，菌株NEAU-C3从属于链霉菌菌属，并与菌株Streptomyces hygroscopicus subsp.ossamyceticus JCM4965T(97.7％)和Streptomyces torulosus JCM4872T(97.7％)相似性最高。系统发育分析结果显示，菌株NEAU-C3在Neighbour-joining和Maximum-likelihood两种建树图谱中形成了一独立分支，并且与最高相似性菌株S.hygroscopicus subsp.ossamyceticus JCM4965T和S.torulosus JCM4872T的DNA同源性均小于新菌种鉴定阈值70％，结合表型特征及生理生化特征上的差别，确定菌株NEAU-C3为链霉菌菌属的一个新种，根据分离源信息，将菌株NEAU-C3命名为Streptomyces vulcanius。
　　(3)菌株NEAU-JMi的多相分类学鉴定:16S rRNA基因测序结果分析显示，菌株NEAU-JM1从属于小链孢菌属，并与菌株Catellatospora parii NEAU-CL2T(99.5％)，Catellatospora methionotrophica JCM7543T(99.4％),Catellatospora coxensis DSM44901T(99.4％),Catellatospora citrea DSM44097T(99.3％)和Catellatospora chokoriensis JCM12950T(99.2％)相似性最高。系统发育分析结果显示，菌株NEAU-JM1在Neighbour-joining和Maximum-likelihood两种建树图谱中与菌株C.parii NEAU-CL2T形成了一独立分支，并与菌株C.coxensisDSM44901T,C.aurea NEAU-SH16T,C.citrea DSM44097T,C.methionotrophicaJCM7543T和C.chokoriensis JCM12950T在系统发育图谱中最相近。DNA同源性结果显示菌株NEAU-JM1与所有相似菌的同源性均小于新菌种鉴定阈值70％，结合表型特征及生理生化特征上的差别，确定菌株NEAU-JM1为小链孢菌属的一个新种，根据分离源信息，将菌株NEAU-JM1命名为Catellatospora vulcania。
　　(4)菌株NEAU-JM2的多栩分类学鉴定:16S rRNA基因测序结果分析显示，菌株NEAU-JM2从属于小单孢菌属，并与菌株Micromonospora maoerensis NEAU-MES19T(99.5％),Micromonosporazeae NEAU-gq9T(98.9％),Micromonospora saelicesensis Lupac09T(98.8％)和Micromonospora matsumotoense JCM9104T(98.8％)相似性最高。系统发育分析结果显示，菌株NEAU-JM2在Neighbour-joining和Maximum-likelihood两种建树图中，均与菌株M.maoerensis NEAU-MES19T和M.matsumotoense JCM9104T建在同一分支。菌株N EA U-JM2的gyrB基因相似性比对分析显示，M.maoerensis NEAU-MES19T(94.5％)，M.zeae NEAU-gq9T(94.0％)，Msaelicesensis Lupac09T(94.8％)和M.matsumotoense JCM9104T(92.9％)为其相似性最高的菌株，进一步系统发育分析显示，菌株NEAU-JM2形成一独立分支，不与其任何最高相似性菌株邻近。通过系统发育分析、形态特征、生理生化特征比较及DNA同源性分析确定菌株NEAU-JM2为小单孢菌菌属的一个新种，根据分离源信息，将菌株NEAU-JM2命名为 Micromonospora vulcania。
　　(5)抑菌活性测试实验结果显示，菌株LW1-3对10种病原真菌均表现出了良好的抗菌活性，结合细菌抑制实验结果，对菌株LW1-3进行后续的化合物分离，得到2个单体化合物（compound1和compound2），经结构鉴定分别为巴佛洛霉素A1(bafilomycin A1)和巴佛洛霉素K(bafilomycin K)。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 放线菌研究进展

1．2 特殊生境中放线菌资源研究

1．2．1 极端环境放线菌

1．2．2 洞穴放线菌

1．2．3 昆虫放线菌

1．2．4 海洋放线菌

1．2．5 其他特殊生境放线菌

1．3 火山放线菌的研究现状

1．4 微生物农药

1．5 研究目的与意义

1．6 课题来源

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验样品

2．1．2 供试菌株

2．1．3 实验试剂

2．1．4 主要仪器

2．2 主要培养基及配制方法

2．2．1 分离培养基

2．2．2 纯化培养基

2．2．3 发酵培养基

2．2．4 生测培养基

2．2．5 形态学观察培养基

2．2．6 生理生化培养基

2．3 火山湖放线菌的分离

2．3．1 样品的采集及预处理

2．3．2 放线菌的分离及保藏

2．4 菌株的初步归类

2．5 新种放线菌的多相分类学鉴定

2．5．1 形态及培养特征

2．5．2 生理生化鉴定

2．5．3 化学分类鉴定

2．5．4 系统发育分析

2．6 抑菌生物活性检测

2．6．1 发酵液预处理

2．6．2 发酵液粗提物抑细菌活性检测

2．6．3 发酵液粗提物抑真菌活性检测

2．7 活性代谢产物的分离及鉴定

2．7．1 活性代谢产物的分离纯化

2．7．2 活性代谢产物的结构鉴定

3 结果与分析

3．1 火山湖放线菌的分离结果及初步归类

3．2 新种放线菌的多相分类学鉴定结果与分析

3．2．1 菌株Streptomyces vulcanius NEAU-C3的分类学鉴定

3．2．2 菌株Catellatospora vulcania NEAU-JM1的分类学鉴定

3．2．3 菌株Micromonospora vulcania NEAU-JM2的分类学鉴定

3．3 火山湖放线菌的抑菌活性检测

3．3．1 抑细菌活性检测

3．3．2 抑真菌活性检测

3．4 菌株LW1-3的活性代谢产物研究

3．4．1 菌株LW1-3的活性代谢产物的分离纯化

3．4．2 菌株LW1-3活性代谢产物的结构鉴定

4 讨论

4．1 火山湖新种放线菌

4．1．1 新种放线菌Streptomyces vulcanius

4．1．2 新种放线菌Catellatospora vulcania

4．1．3 新种放线菌Micromonospora vulcania

4．2 火山湖放线菌的分离

4．3 火山湖放线菌的活性代谢产物

5 结论

5．1 本研究主要结论

5．2 本研究创新点

致谢

参考文献

攻读博士学位期间发表的学术论文