过量锰导致鸡脑组织和神经细胞凋亡的机理研究

摘要

锰(Mariganese，Mn)是一种人和动物必需的微量元素，随着锰在工业和农业广泛使用，引起了锰污染。神经系统是过量锰作用的对象之一，锰污染能使工人出现精神疾病症状，影响儿童智力发育。畜禽误食过量锰会出现精神萎靡症状，甚至死亡，造成畜禽养殖损失。本试验旨在研究过量锰对鸡脑组织和鸡胚神经细胞凋亡的影响，为鸡锰神经毒性提供基础数据，同时为诊断、治疗畜禽生产中动物锰中毒提供参考。
　　本试验包括体内试验和体外试验。体内试验中，将240只1日龄海兰公鸡用标准日粮饲喂7天，然后随机分为对照组和3个处理组，对照组饲喂标准日粮(含锰127.88mg/kg)，3个处理组在标准日粮中分别添加不同水平氯化锰，使日粮锰水平分别达到600、900和1800mg/kg。饲喂30、60和90天时采集鸡大脑、小脑、丘脑和脑干组织进行相关指标的检测。体外试验中，取6-8日龄鸡胚，分离出鸡胚神经细胞。试验分为一个对照组和6个锰处理组，对照组使用DMEM培养基培养，6个处理组在DMEM培养基添加不同浓度的氯化锰，使培养基中氯化锰的浓度分别达到0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0mM，培养12、24、36和48小时时，收集细胞，进行相关指标的检测。鸡饲养和采集样品时观察鸡临床症状和剖检症状，采用火焰原子吸收法和石墨炉原子吸收法分别检测鸡脑组织和血液锰含量，采用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色法和醋酸铀和柠檬酸铅双染色法分别观察鸡脑组织显微和超微结构，采用细胞计数试剂盒-8(Cell counting kit-8，CCK-8)法和吖啶橙/溴化乙锭(Acridine orange/Ethidium bromide，AO/EB)双染色法分别检测鸡胚神经细胞活力和凋亡状态，采用试剂盒法检测鸡脑组织和鸡胚神经细胞超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)和总抗氧化能力(Total antioxidant capacity,T-AOC)活性和一氧化氮(Nitric oxide，NO)含量和诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)活性，采用实时定量PCR法(Real time quantitative PCR，qPCR)检测炎症因子核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、iNOS、环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)和前列腺素E合成酶(prostaglandin E synthase，PTGEs)、细胞因子白细胞介素-4(Interleukin-4，IL-4)、IL-7、IL-I0、IL-17、干扰素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）和转化生长因子-β4(Transforming growth factor-β4，TGF-β4)、凋亡基因p53、B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma2，Bcl-2)、B细胞淋巴瘤-加长(B-cell lymphoma-extra large，Bcl-x)、B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(B-cell lymphoma2-associated X protein，Bax)、B细胞淋巴瘤2同源拮抗剂/杀手(B-cell lymphoma2homologous antagonist/killer，Bak)、fas和半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)和热休克蛋白(Heat Shock Protein，HSP)HSP27、HSP40、HSP60、HSP70和HSP90mRNA表达，采用蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测炎症因子NF-κB、iNOS和PTGEs，凋亡基因p53、Bcl-2、Bax和caspase-3和热休克蛋白HSP60、HSP70和HSP90蛋白表达。结果表明:
　　(1)过量锰导致鸡脑组织和血液锰含量升高，且鸡脑组织锰具有时间和剂量效应，鸡血液锰具有剂量效应，过量锰导致鸡脑组织锰蓄积。
　　(2)过量锰导致鸡脑组织炎症损伤，炎症损伤程度随着锰处理剂量和处理时间的增加而增加。过量锰诱导鸡脑组织和鸡胚神经细胞炎症因子NF-κB、TNF-α、iNOS、COX-2和PTGEs mRNA表达以及NF-κB、iNOS和PTGEs蛋白表达，增加NO含量和iNOS活性，且鸡脑组织的以上指标具有时间和剂量效应量，鸡胚神经细胞炎症因子蛋白表达具有剂量效应和时间效应，鸡胚神经细胞炎症因子mRNA表达、NO含量和iNOS活性具有剂量效应。过量锰导致鸡脑组织和鸡胚神经细胞炎性反应和炎性损伤。
　　(3)过量锰从组织形态学角度导致了鸡脑组织凋亡，且随着锰处理剂量和处理时间的增加，鸡脑组织凋亡程度加剧。过量锰从细胞形态学角度导致鸡胚神经细胞凋亡，且细胞凋亡的数目随着剂量的增加而增加。过量锰诱导了鸡脑组织和鸡胚神经细胞凋亡基因p53、Bax、Bak、fas和caspase-3mRNA表达以及p53、Bax和caspase-3蛋白表达，抑制了Bcl-2和Bcl-x mRNA表达以及Bcl-2蛋白表达。鸡脑组织凋亡基因mRNA和蛋白表达以及鸡胚神经细胞凋亡基因蛋白表达具有剂量效应和时间效应，鸡胚神经细胞凋亡基因mRNA表达具有剂量效应。过量锰导致鸡脑组织和鸡胚神经细胞凋亡。
　　(4)过量锰降低了鸡脑组织和鸡胚神经细胞SOD和T-AOC活性，且鸡脑组织SOD和T-AOC活性具有剂量效应和时间效应，鸡胚神经细胞SOD和T-AOC活性具有剂量效应。过量锰导致了鸡脑组织和鸡胚神经细胞氧化应激。
　　(5)过量锰诱导了鸡脑组织和鸡胚神经细胞细胞因子IL-7和IFN-γmRNA表达，抑制了细胞因子IL-4、IL-10、IL-17和TGF-β4mRNA表达，且鸡脑组织细胞因子mRNA表达具有剂量效应和时间效应，鸡胚神经细胞细胞因子mRNA表达具有剂量效应。过量锰引起了鸡脑组织和鸡胚神经细胞免疫反应。
　　(6)过量锰诱导鸡脑组织和鸡胚神经细胞热休克蛋白HSP27、HSP40、HSP60、HSP70和HSP90mRNA表达以及HSP60、HSP70和HSP90蛋白表达。鸡脑组织热休克蛋白mRNA和蛋白表达以及鸡胚神经细胞热休克蛋白蛋白表达具有剂量效应和时间效应，鸡胚神经细胞热休克蛋白mRNA表达具有剂量效应。热休克蛋白在过量锰诱导的鸡脑组织和鸡胚神经细胞凋亡中发生保护性反应。
　　(7)过量锰对大脑NF-κB和TNF-αmRNA表达，NF-κB、iNOS和PTGEs蛋白表达韵影响最大，对丘脑Bcl-2、HSP60和HSP90蛋白表达的影响最大，对大脑和丘脑NF-κB、IL-4和IL-17mRNA表达以及p53蛋白表达的影响最大。过量锰对大脑和丘脑的毒性大于小脑和脑干的毒性。
　　过量锰导致鸡脑组织和鸡胚神经细胞凋亡，氧化应激、炎性损伤、免疫反应和热休克蛋白参与了过量锰导致的鸡脑组织和鸡胚神经细胞凋亡。

目录

声明

摘要

1 前言

1．3 过量锰对神经系统的危害

1．4 过量锰能导致氧化应激

1．5 过量锰能导致炎症反应

1．6 过量重金属能导致免疫反应

1．7 过量锰能导致细胞凋亡

1．8 过量锰能增加热休克蛋白表达

1．9 研究目的，意义及创新点

2 材料与方法

2．1 主要仪器

2．2 主要试剂

2．3 标准日粮组成、试验动物模型和动物管理方案

2．3．1 标准日粮组成

2．3．2 试验动物模型

2．3．3 动物管理方案

2．4 鸡脑组织样品的采集与处理

2．5 鸡临床症状与剖检观察

2．6 鸡脑组织和血液锰含量检测

2．7 鸡脑组织显微结构的观察

2．8 鸡脑组织超微结构的观察

2．9 体外试验模型

2．10 鸡胚神经细胞活力检测

2．11 鸡胚神经细胞凋亡检测

2．12 鸡脑组织和鸡胚神经细胞试剂盒检测

2．13 鸡脑组织和鸡胚神经细胞基因mRNA表达检测

2．13．1 引物设计与合成

2．13．2 总RNA提取和cDNA合成

2．13．3 实时定量PCR

2．14 鸡脑组织和鸡胚神经细胞基因蛋白表达检测

2．15 试验数据的分析与统计

3 结果与分析

3．3．1 鸡脑组织显微结构观察

3．3．2 鸡脑组织超微结构观察

3．4 鸡胚神经细胞细胞活力

3．5 鸡胚神经细胞凋亡观察

3．6 鸡脑组织和鸡胚神经细胞试剂盒

3．6．1 鸡脑组织和鸡胚神经细胞SOD活性

3．6．2 鸡脑组织和鸡胚神经细胞T-AOC活性

3．6．3 鸡脑组织和鸡胚神经细胞NO含量

3．6．4 鸡脑组织和鸡胚神经细胞iNOS活性

3．7 鸡脑组织和鸡胚神经细胞炎症因子、细胞因子、凋亡基因和热休克蛋白mRNA表达

3．7．1 基因qPCR检测方法的鉴定

3．7．2 鸡脑组织和鸡胚神经细胞炎症因子(NF-κB、TNF-α、iNOS、COX-2和PTGEs)mRNA表达

3．7．3 鸡脑组织和鸡胚神经细胞细胞因子(IL-4、IL-7、IL-10、IL-17、IFN-γ和TGF-β4)mRNA表达

3．7．4 鸡脑组织和鸡胚神经细胞凋亡基因(p53、Bcl-2、Bcl-x、Bax、Bak、fas和caspase-3)mRNA表达

3．7．5 鸡脑组织和鸡胚神经细胞热休克蛋白(HSP27、HSP40、HSP60、HSP70和HSP90)mRNA表达

3．8 鸡脑组织和鸡胚神经细胞炎症因子、凋亡基因和热休克蛋白蛋白表达

3．8．1 鸡脑组织和鸡胚神经细胞炎症因子(NF-κB、iNOS和PTGEs)蛋白表达

3．8．2 鸡脑组织和鸡胚神经细胞凋亡基因(p53、Bcl-2、Bax和caspase-3)蛋白表达

3．8．3 鸡脑组织和鸡胚神经细胞热休克蛋白(HSP60、HSP70和HSP90)蛋白表达

4 讨论

4．1 过量锰导致鸡脑组织和鸡胚神经细胞氧化应激

4．2 过量锰导致鸡脑组织和鸡胚神经细胞炎性损伤

4．3 过量锰引起鸡脑组织和鸡胚神经细胞免疫反应

4．4 过量锰导致鸡脑组织和鸡胚神经细胞凋亡

4．5 过量锰增加鸡脑组织和鸡胚神经细胞热休克蛋白表达

4．6 过量锰对鸡大脑、小脑、丘脑和脑干毒性的差异

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表的学术论文