HP-PRRSV诱导仔猪胸腺细胞死亡类型的鉴定及激活JAK/STAT通路的研究

摘要

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的免疫抑制性传染病，其特征是母猪严重繁殖障碍，仔猪和生长猪出现呼吸道症状，继发细菌感染的风险增加。自2006年在中国第一次暴发高致病性PRRS(High pathogenic-PRRS，HP-PRRS)以来，HP-PRRS已给中国养猪业造成巨大的经济损失。PRRSV感染诱发仔猪免疫器官病变，导致宿主免疫反应的严重障碍。与经典的PRRS比较，HP-PRRS的特点是高发病率、高死亡率、高热以及混合继发感染严重。本实验室在2010年发现感染HP-PRRSV（HuN4株）的断奶仔猪胸腺发生明显的萎缩，萎缩程度高达90％。在随后的几年间，本实验室深入研究HP-PRRSV HuN4毒株对仔猪胸腺的损伤情况，首先在感染病毒的仔猪中发现了胸腺萎缩现象，进一步发现萎缩的胸腺内存在细胞凋亡且凋亡的细胞主要发生在未感染的细胞中。
　　本研究拟在前期基础上，基于胸腺细胞体外培养系统(PTCS)，深入研究HP-PRRSV感染仔猪胸腺内病毒感染导致的细胞死亡类型及激活JAK/STAT信号通路的机制，探讨HP-PRRSV感染诱导仔猪胸腺细胞减少的机制。为深入阐明HP-PRRSV诱导的免疫抑制及机体对HP-PRRSV的免疫机制提供理论基础。
　　为明确HP-PRRSV感染诱导仔猪胸腺细胞死亡的类型及激活JAK/STAT信号通路，本实验选取21日龄SPF仔猪胸腺进行实验，首先建立胸腺原代细胞体外培养系统，感染HP-PRRSV后，鉴定HP-PRRSV诱导胸腺细胞死亡的类型及激活JAK/STAT通路的机制。在病毒感染不同时间点收取细胞，通过电镜观察HP-PRRSV感染的胸腺细胞体外培养系统形态学变化。结果显示，细胞的死亡类型与细胞凋亡的形态学变化相吻合，并在40h时凋亡细胞较多，表明在建立的胸腺原代细胞培养系统中HP-PRRSV感染引起的胸腺细胞的死亡类型为细胞凋亡。前期研究发现HP-PRRSV感染胸腺内STAT-1蛋白含量变化明显，且该蛋白存在于JAK/STAT经典途径中。本研究进一步利用此系统研究HP-PRRSV感染对JAK/STAT信号通路的影响，首先采用IFN-α处理细胞后观察病毒感染情况，发现IFN-α抑制HP-PRRSV的感染。随后采用Western blot实验检测STAT-1蛋白含量的变化情况，结果表明HP-PRRSV感染引起STAT-1蛋白表达上调，激活了JAK/STAT通路。而JAK/STAT的激活可以通过2种途径，1条是通过泛素化-蛋白酶体途径，1条是自噬体溶酶体途径。MG132是泛素化的抑制剂，3-MA具有抑制细胞自噬的作用，本研究使用此两种药物研究HP-PRRSV感染仔猪胸腺细胞体外培养系统JAK/STAT通路的变化。本实验通过胸腺原代细胞体外培养系统感染HP-PRRSV后用MG132和3-MA两种药物进行处理细胞，通过处理不同时间的细胞进行Western blot实验检测观察其变化。结果显示经过MG132处理后的细胞STAT-1蛋白含量出现明显的变化，而经过3-MA处理后的细胞STAT-1蛋白含量与对照组无明显差别。实验结果表明，HP-PRRSV感染激活JAK/STAT信号通路通过泛素化途径引起。以上实验结果表明:HP-PRRSV诱导胸腺细胞的死亡类型为细胞凋亡;HP-PRRSV复制可激活JAK/STAT信号通路，与泛素化途径有关。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1．2 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)

1．2 PRRS的临床症状

1．3 PRRS的疫苗研究

1．4 程序性细胞死亡

1．4．1 细胞凋亡

1．4．2 细胞焦亡

1．4．3 坏死

1．6 HP-PRRSV感染与胸腺损伤

1．6．1 胸腺组织

1．7．1 HP-PRRSV与JAK／STAT信号通路的关系

1．8 研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物、实验毒株、细胞

2．1．2 实验主要器材

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 胸腺原代细胞体外培养系统(PTCS)的建立

2．2．3 HP-PRRSV感染仔猪胸腺细胞激活JAK／STAT通路的研究

3 结果

3．1 胸腺原代细胞体外培养系统的建立

3．2．2 HP-PRRSV感染胸腺原代细胞培养系统的鉴定

3．2．3 HP-PRRSV诱导的胸腺细胞死亡的类型为细胞凋亡

3．3．2 HP-PRRSV复制诱导STAT-1的上调

3．3．3 灭活HP-PRRSV不能激活JAK／STAT信号通路

3．3．4 HP-PRRSV促进STAT-1的上调与细胞自噬无关

3．3．5 HP-PRRSV通过泛素-蛋白酶体系统促进STAT-1的上调

4 讨论

4．1 胸腺原代细胞体外培养系统(PTCS)的建立

4．3 HP-PRRSV感染仔猪胸腺细胞激活JAK／STAT通路的研究

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文