mRNA差异显示法研究密叶杨×胡杨NaHCO胁迫下基因的表达（国家“973”项目树木分子育种—耐盐基因克隆部分）

摘要

为了研究胡杨耐盐碱的分子机理,以正常生长和用4﹪NaHCO<,3>(W/V)处理过的胡杨为研究对象,利用mRNA差异显示(DDRT-PCR)技术,通过Reverse Northern杂交获得差异表达片段,并对基因片段测序和序列分析等研究.所得结果如下:(1)胡杨在受到4﹪NaHCO<,3>溶液处理后有特异基因表达.用NaHCO<,3>溶液浇灌胡杨苗3天后,取胡杨叶片进行mRNA差异显示,研究表明NaHCO<,3>溶液处理后出现基因的差异表达.(2)CTAB法提取胡杨组织的RNA质量高、完整性好,完全适用于DDRT-PCR,是一种快速、可靠的树木RNA提取方法.(3)建立了胡杨的mRNA差异显示的体系.利用三种锚定引物和16种10碱基随机引物组合,展示了胡杨正常条件下和盐碱条件下基因表达差异方式.用银染法代替了放射性标记检测,操作起来更安全易行.该方法与Reverse Northern斑点杂交结合使用,并进行多次重复操作,可很好地克服其假阳性高的缺点.(4)共获了24个差异条带的克隆.经Reverse Northern杂交获得了4个阳性克隆.对其进行测序,序列相似性分析表明T<,12>C-P1片段与atpH基因(该基因编码ATPase的一个亚基)有很高同源性,为重要的抗盐碱基因;T<,12>G-P6片段与已知蛋白序列同源性较低;T<,12>C-AP4序列与WD-40重复蛋白基因同源性较高;T<,12>A-AP4片段与钠离子通道蛋白基因有一定同源性,为抗盐碱相关基因.

目录

文摘

英文文摘

1前言

1.1胡杨和密叶杨的形态学特性及地理分布

1.2植物耐盐碱性的研究现状

1.2.1盐碱胁迫下植物的生理变化

1.2.2植物耐盐机制

1.2.3植物耐盐碱相关基因的筛选

1.2.4国内胡杨耐盐碱研究现状

1.3真核生物mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)的研究进展

1.3.1差异显示技术及其优点

1.3.2差别显示技术存在的主要问题及改进

1.4研究的目的和意义

2材料与方法

2.1实验方案

2.2实验材料

2.2.1胡杨的组织来源

2.2.2主要仪器与试剂

2.2.3所用溶液及配制

2.3实验方法

2.3.1胡杨叶片组织总RNA的提取

2.3.2总RNA的酚仿抽提纯化处理

2.3.3总RNA的去除DNA纯化处理

2.3.4逆转录体系的建立

2.3.5变性聚丙烯酰胺凝胶分离差异片段

2.3.6差异片段的回收及第二次PCR扩增

2.3.7差异片段的克隆

2.3.8差异序列的Reverse Northern斑点杂交

2.3.9克隆片段的序列测定

2.3.10差异片段的碱基序列与网上序列同源性比较

3结果与分析

3.1总RNA的制备

3.2 mRNA差异条带的显示

3.3回收条带的二次PCR扩增

3.4 DNA重组体的构建及初步筛选

3.5重组质粒的PCR检测鉴定结果

3.6 Reverse Northern斑点杂交检测结果

3.7阳性重组体的测序

3.8序列的同源性分析

4讨论

5结论

参考文献

英文缩写词对照表

致谢