青杨脊虎天牛细胞色素P450基因的克隆与表达及氰戊菊酯对其的诱导作用

摘要

细胞色素P450单加氧化酶系在生物体对外源化合物的代谢和内源化合物的调节都起着非常重要的作用，许多证据表明昆虫杀虫剂抗性的产生与单加氧化酶系介导的代谢反应有关，其关键组份细胞色素P450作为终端氧化酶能氧化多样的底物。青杨脊虎天牛是一种危害杨树、柳树等多种阔叶树的蛀干性害虫，在我国东北局部地区造成了严重的危害。为深入了解青杨脊虎天牛细胞色素P450的结构与功能，就青杨脊虎天牛细胞色素P450基因的克隆、表达及诱导开展了研究，主要研究结果如下：
　　根据报道的十几种昆虫CYP4家族基因的氨基酸序列的保守区域设计一对引物，采用RT-PCR方法以青杨脊虎天牛中肠为材料提取mRNA，克隆了青杨脊虎天牛CYP4G2基因(GenBank登录号:EF429250)。序列分析表明，青杨脊虎天牛CYP4G2基因编码区阅读框全长387bp，编码129个氨基酸残基，预测分子量和等电点分别为16.9KD和5.75;推导的氨基酸序列与已报道的昆虫CYP4家族氨基酸序列同源性较高(63％～86％)经与已知CYP4家族其它几乎所有成员氨基酸同源比对发现，青杨脊虎天牛CYP4G2基因与马铃薯甲虫和赤拟谷盗亲源关系最近。
　　将青杨脊虎天牛CYP4G2基因克隆进原核表达载体pET-28a(+)，转化到大肠杆菌JM109细胞中，经0.3 mmol/L IPTG诱导蛋白质表达。SDS-PAGE电泳分析表明在约22kD大小位置，转化青杨脊虎天牛CYP4G2基因的JM109菌与对照JM109菌和空pET-28a(+)转化JM109菌相比都出现了一条特异性的蛋白质条带，与预期大小一致，推测青杨脊虎天牛CYP4G2基因在大肠杆菌中得到表达。
　　将氰戊菊酯配制成2mg/g的浓度，点滴于青杨脊虎天牛体壁，处理不同时间后取对照和经氰戊菊酯处理的成虫解剖，分别测定体壁、中肠、脂肪体的P450含量。结果表明氰戊菊酯对P450酶系中不同的组分具有不同的诱导作用，对中肠P450含量的诱导最为显著，并表现出了复杂的诱导机制。
　　青杨脊虎天牛CYP4G2基因的成功克隆和表达为进一步通过构建P450体外重组体系，研究它对外源物质的代谢机制，并最终确定其功能打下了基础。

目录

摘要

1 绪论

1．1 细胞色素P450酶系与细胞色素P450

1．1．1 细胞色素P450酶系

1．1．2 细胞色素P450

1．1．3 P450基因的命名法则

1．1．4 P450的多样性

1．1．5 P450的可诱导性

1．2 昆虫P450酶系的重要功能

1．2．1 保幼激素及其类似物的代谢

1．2．2 脂肪酸的代谢

1．2．3 信息素的代谢

1．2．4 蜕皮甾醇的代谢

1．2．5 P450与昆虫抗药性

1．3 昆虫P450的研究方法

1．4 本研究的立题依据与主要研究内容

1．4．1 立题依据

1．4．2 主要研究内容

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 供试青杨脊虎天牛

2．1．2 菌种与载体

2．1．3 试剂与仪器

2．1．4 常用试剂的配置

2．2 实验方法

2．2．1 总RNA的提取与检测

2．2．2 引物的设计

2．2．3 cDNA第一链的合成

2．2．4 PCR的扩增

2．2．5 PCR产物的纯化

2．2．6 质粒的连接

2．2．7 感受态细胞的制备与质粒的转化

2．2．8 阳性克隆的筛选

2．2．9 质粒DNA的小量抽提

2．2．10 连接质粒的酶切鉴定与PCR鉴定

2．2．11 序列的测定和分析

2．2．12 原核表达载体的构建

2．2．13 序列的测定

2．2．14 重组质粒的表达

2．2．15 表达产物的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测

2．2．16 氰戊菊酯诱导处理

2．2．17 微粒体酶液的制备

2．2．18 细胞色素P450含量的测定

3 结果与分析

3．1 青杨脊虎天牛CYP450基因的克隆与分析

3．1．1 总RNA的提取与检测

3．1．2 CYP450基因的扩增和克隆

3．1．3 阳性克隆的鉴定

3．1．4 序列的测定和分析

3．2 青杨脊虎天牛CYP4G2基因的原核表达载体的构建

3．2．1 pET-CYP4G2的构建及鉴定

3．2．2 序列的测定

3．2．3 诱导表达及SDS-PAGE分析

3．3 氰戊菊酯对青杨脊虎天牛成虫的诱导作用

结论与讨论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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