裂蹄木层孔菌子实体水提物体外诱导HepG2细胞凋亡

摘要

裂蹄木层孔菌（Phellinus linteus）在东方是著名的有多种生物活性的药用真菌，广泛用于治疗各种疾病，如口腔溃疡、胃肠紊乱、炎症、淋巴疾病和各种癌症。通常认为P.linteus对于癌细胞没有直接的毒性，但对于P.linteus子实体水提物(WEPL)直接作用于癌细胞的研究鲜见报道，其抗肿瘤机制也不清楚。本文研究发现WEPL对HepG2人类克隆癌细胞系有直接的抗增殖作用。用0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL/mL WEPL处理HepG2细胞24、48、72h后，MTT法可见WEPL对体外培养的细胞有明显的抑制作用，与对照组相比有明显差异。其抑制细胞增殖作用呈浓度和时间依赖性;透射电镜下细胞表现为细胞固缩，胞质空泡化，凋亡小体形成。流式细胞仪技术检测到AnnexinⅤ染色呈阳性的出现都是细胞发生凋亡的标志特征。证实WEPL体外直接诱导HepG2细胞凋亡。DNA Ladder同电镜和流式细胞技术所得结果均证实WEPL处理48h后HepG2细胞处于凋亡前期及中期。WEPL对HepG2细胞抗增殖和凋亡的作用与Bax和Bcl-2的诱导有显著关系。RT-PCR和Western Blot分析证实WEPL刺激Bax mRNA和蛋白表达量上调Bcl-2 mRNA和蛋白表达量下调进而诱导了细胞凋亡。结论证实WEPL诱发的人类克隆肝癌细胞系HepG2的细胞凋亡可能是通过上调Bax、下调Bcl-2活性来实现的。

目录

摘要

1 绪论

1．1 抗肿瘤研究进展

1．2 P．linteus研究进展

1．2．1 P．linteus的培养

1．2．2 多糖提取及多糖分子结构

1．2．3 P．linteus的药用功能

1．2．4 P．linteus的发展应用

1．3 细胞凋亡

1．3．1 细胞凋亡的概念

1．3．2 细胞凋亡的特征

1．3．3 细胞凋亡的分子机制

1．3．4 细胞凋亡的生化特征检测

1．3．5 细胞凋亡的意义

2 实验方法

2．1 材料、试剂和仪器

2．1．1 材料

2．1．2 主要试剂

2．1．3 仪器

2．2 方法

2．2．1 细胞培养

2．2．2 P．linteus子实体水提物(WEPL)的制备

2．2．3 MTT法研究WEPL对HepG2细胞的作用

2．2．4 电镜观察超微结构的变化

2．2．5 流式细胞术分析

2．2．6 DNA Ladder凝胶电泳检测

2．2．7 RT-PCR法研究WEPL对Bax和Bcl-2 mRNA转录水平的作用

2．2．8 Western Blot法研究Bax和Bcl-2蛋白表达的变化

3 结果与分析

3．1 MTT结果分析

3．2 电镜观察超微结构的变化

3．3 流式细胞术结果分析

3．4 DNA Ladder结果

3．5 RT-PCR法研究WEPL对Bax和Bcl-2 mRNA转录水平的作用

3．6 Western Blot法研究Bax和Bcl-2蛋白变化的情况

3．6．1 蛋白定量

3．6．2 Western Blot研究蛋白变化

4 讨论

结论

参考文献

附图

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

声明