南方红豆杉中三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇高效诱导提取纯化工艺研究

摘要

本文以可再生南方红豆杉枝叶为原料,提取、分离、纯化紫杉烷类化合物-三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇。通过对南方红豆杉枝叶中三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇含量的动态变化,以及紫外辐射、氧气空化、酸和酶诱导对南方红豆杉枝叶中三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇含量变化的影响,确定了最佳采收期和酶诱导提取工艺,并首次通过大孔吸附树脂柱层析,正反相柱层析相结合的方法对三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇的纯化工艺条件进行了系统的研究,得出如下结论:
　　 一、建立了三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇的检测方法并掌握了二者含量时空变化趋势:
　　 1.三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇的HPLC分析方法:色谱柱:Curosil-PFP色谱柱5μ(250 mm×4.6 mm I.D.),流动相:乙腈/水(42/58,v/v),流速:1 mL/min,进样量10μL,柱温:35℃,检测波长:234 nm。
　　 2.南方红豆杉枝叶中三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇含量的动态变化规律和最佳采收期:
　　 三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇在一年中的含量变化趋势较为一致,均呈现先升高后降低再升高的趋势。其中11月份时二者含量达到峰值,在叶中三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇含量分别为0.0342 mg/g和0.0271mg/g,在茎中二者含量分别为0.00272 mg/g和0.012 mg/g,因此确定11月为南方红豆杉的最佳采收期。
　　 通过对比新老茎叶中三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇含量的变化,发现新茎叶中二者含量约为老茎叶中的50％,说明三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇都随着茎叶的成熟而逐渐累积。
　　 二、确立并优化了环境诱导提高三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇含量的方法:最佳诱导方法:酶诱导;酶种类:纤维素酶;酶浓度:1 mg/mL;酶诱导时间:24h;温度:45℃。三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇的含量分别达到了0.027 mg/g和0.024 mg/g,较之前未经酶诱导样品提高了55.21％和52.13％。
　　 三、确定并优化了酶诱导后三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇的提取工艺:提取方法:负压空化;提取溶剂:80％乙醇溶液;总液固比:30:1;提取时间:每次45min;提取次数:3次。三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇的含量分别为0.024 mg/g和0.021 mg/g。经酶转化后的三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇收率分别为89.61％和83.24％。
　　 四、富集纯化得到高纯度的三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇:
　　 1.首次应用大孔吸附树脂柱层析法富集南方红豆杉粗提物中三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇。参数如下:大孔吸附树脂类型:AB-8;上样量与树脂量比:1:15(湿重);洗脱剂组分及比例:50％乙醇溶液30BV、60％乙醇溶液10BV、65％乙醇溶液15BV。最终三尖杉宁碱纯度为0.875％,收率为76.54％,7-表-10-去乙酰基紫杉醇纯度为2.581％,收率为86.78％。
　　 2.采用正反相硅胶柱层析结合纯化三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇。
　　 正相硅胶柱层析条件:硅胶规格:300～400目;上样量与硅胶量比例:1:40;洗脱剂组分及比例:三氯甲烷.甲醇,90/1(v/v);洗脱流速:30 d/min。
　　 反相硅胶柱层析条件:硅胶规格:ODS(C18);上样量与硅胶量比例:1:195;洗脱剂组分及比例:乙腈-水,35/65(v/v);洗脱流速为:20 d/min。
　　 经过正、反相硅胶柱层析后,最后获得了纯度分别为90.38％和93.47％的三尖杉宁碱和7-表-10-去乙酰基紫杉醇,收率分别为77.25％和63.22％。
　　 经过酶诱导-负压空化提取-大孔树脂柱层析-正相柱层析-反相柱层析等一系列工艺后,最终三尖杉宁碱纯度为90.38％,总收率为82.23％,得率为0.014 mg/g;7-表-10-去乙酰基紫杉醇纯度为93.47％,总收率为69.55％,得率为0.011 mg/g。此工艺路线较传统工艺具有成本低,污染小,可行性强等特点,为开拓紫杉醇来源提供了有力的技术支持,具有重要的理论意义和应用价值。