以植物病毒为载体建立新型的载体-半抗原免疫体系

摘要

一些免疫原性较弱的小分子抗原或半抗原很难刺激小鼠体内的免疫系统而产生免疫应答，进而无法获得单克隆抗体，因此半抗原需要和其它分子量较大的“非抗原性”载体结合以便激发机体有效的免疫应答发生。研究发现，植物病毒可成为半抗原高效的递呈平台。病毒载体的融合肽已被证明能有效提高细胞免疫功能。植物病毒通过遗传和化学改性可被用来作为抗原的载体，其有效控制抗原在其表面的高密度和高重复的排列，可提高通过交联B细胞受体激活B细胞的反应，进而导致早期B细胞扩增并引起强的IgM抗体反应，以及提高切换到IgG的效率，因此植物病毒在作为半抗原新型载体方面有着巨大的潜力。
　　本研究利用烟草花叶病毒(TMV)、豇豆花叶病毒(CPMV)作为抗原的载体，通过化学方法与半抗原雌三醇（μE3）连接形成植物病毒载体-μE3复合体，对小鼠进行免疫，然后采用高效高通量单克隆抗体杂交瘤筛选技术获得针对μE3的高亲和力单克隆抗体，最终形成一种植物病毒载体-半抗原复合体进行免疫、融合、高通量筛选来获得高亲和力单克隆抗体的免疫体系;通过设计两种最为普遍形状的植物病毒载体:棒状的TMV和球形的CPMV，来证明植物病毒的形状对产生抗体的效价和特异性的影响。
　　本研究主要获得以下结果:
　　(1)μE3-3-HS通过EDC和NHS活化附着在TMV-EPMK和CPMV的外表面，形成TMV-EPMK-μE3和CPMV-μE3复合物，TMV-EPMK-μE3的链接效率约为50％，约2个μE3连接到一个CPMV亚基上。透射电镜(TEM)分析结果显示TMV-EPMK和CPMV颗粒与μE3结合后仍保持完整结构，使病毒的抗原性得到了保护。植物病毒的表面特性已经被连接上的μE3所取代，μE3成为了TMV-EPMK和CPMV表面的抗原决定簇。
　　(2)用CPMV-μE3、TMV-EPMK-μE3、 KLH-μE3和BSA-μE3对小鼠进行免疫。CPMV-μE3、KLH-μE3和BSA-μE3免疫的小鼠血清效价基本相同，为5×10-6，效价最高的为TMV-EPMK-μE3免疫的小鼠血清，为2.5×10-6，明显高于其它三个载体，说明棒状的的TMV-EPMK作为载体使μE3具有了更强的免疫原性，更能刺激机体的免疫系统产生分泌相应抗体的B细胞，进而产生免疫应答反应;
　　(3)对通过TMV、CPMV、TMV-EPMK-μE3、 CPMV-μE3、 KLH-μE3和BSA-μE3免疫小鼠、细胞融合及筛选获得的各1株分泌抗体效价最高的杂交瘤细胞进行了亚克隆，共6株，分别对应各自抗原命名为TMV1-1、CPMV1-1、TE1-1、CE1-1、KE1-1和BE1-1。TMV1-1和CPMV1-1的效价在10-7左右;抗μE3的抗体TE1-1和CE1-1最低检测限约为1 ng，抗体效价为1.5×10-8; KE1-1和BE1-1最低检测限约为5 ng，抗体效价为4×10-8。
　　(4) SDS-PAGE电泳结果显示6株抗体分别在25 kD和50 kD处各有一条清晰的条带，为轻链与重链位置，其它位置没有出现杂带，纯度均在95％以上。
　　(5)获得的6株抗体经罗氏亚型鉴定试剂盒测定轻链类型均为κ。 TMV1-1、CPMV1-1和BE1-1单抗重链为IgG2a; TE1-1、CE1-1和KE1-1单抗重链为IgG2b。
　　(6)对TMV-EPMK-μE3和CPMV-μE3免疫小鼠获得的单克隆抗体特异性进行了检测，TMV-EPMK-μE3免疫小鼠获得的抗体只针对μE3发生反应，而CPMV-μE3免疫小鼠获得的单克隆抗体与TMV-EPMK-μE3、CPMV-μE3和载体CPMV均可发生反应，不具有特异性。
　　本研究表明，烟草花叶病毒(TMV)和豇豆花叶病毒(CPMV)作为半抗原μE3的载体，能够有效地提高半抗原μE3免疫原性，进而刺激机体产生有效免疫应答。此外，植物病毒的形状对产生抗体的效价和特异性也有明显的影响，棒状的TMV为载体免疫小鼠的血清滴度要高于球形的CPMV;经TMV-EPMK-μE3和CPMV-μE3免疫、细胞融合及筛选获得的针对μE3的单克隆抗体效价高于KLH-μE3和BSA-μE3，表明植物病毒作为半抗原的载体相对于传统载体可以制备出更高质量的单克隆抗体。TMV-EPMK-μE3和CPMV-μE3免疫小鼠获得的单克隆抗体特异性检测结果显示，TMV-EPMK-μE3免疫小鼠获得的抗体只针对μE3发生反应，不与载体发生反应，而CPMV-μE3免疫小鼠获得的单克隆抗体与载体发生交叉反应，因此不具有特异性。

目录

摘要

1 绪论

1．1 单克隆抗体研究进展

1．1．1 单克隆抗体在疾病预防中的应用

1．1．2 单克隆抗体在临床诊断及检测中的应用

1．1．3 单克隆抗体在疾病治疗中的应用

1．1．4 单克隆抗体的制备原理

1．1．5 单克隆抗体的制备流程

1．2 雌三醇(μEstriol)简介

1．3 半抗原及载体

1．3．1 半抗原简介

1．3．2 载体简介

1．4 植物病毒简介

1．4．1 TMV和CPMV结构特征

1．4．2 植物病毒在生物检测方面的应用

1．5 酶联免疫吸附检测法(ELISA)

1．6 研究目的、意义

2 植物病毒TMV、CPMV与游离雌三醇的化学连接

2．1 材料

2．2 主要实验试剂

2．3 主要仪器

2．4 主要溶液的配置的

2．4．1 磷酸盐缓冲液配置

2．4．2 SDS-PAGE电泳相关溶液配置

2．5 实验方法

2．5．1 植物病毒TMV-EPMK和CPMV的提取

2．5．2 植物病毒与游离雌三醇(μLE3)连接

2．6 结果与分析

2．6．1 植物病毒TMV-EPMK和CPMV的提取

2．6．2 植物病毒TMV-EPMK和CPMV与雌三醇(μLE3)连接

2．7 讨论

2．8 本章小结

3 植物病毒偶联游离雌三醇免疫小鼠的血清效价分析

3．1 实验动物和细胞

3．2 抗原

3．3 主要实验试剂

3．4 主要仪器

3．5 ELISA用液的配制

3．6 实验方法

3．6．1 免疫A/J小鼠

3．6．2 免疫小鼠尾部血清ELISA检测

3．7 结果与分析

3．7．1 TMV和CPMV免疫小鼠血清效价测定

3．7．2 TMV-EPMK-μE3、CPMV-μE3、KLH-μE3和BSA-μE3免疫小鼠血清效价测定

3．7．3 TMV-EPMK-μE3、CPMV-μE3、KLH-μE3和BSA-μE3免疫小鼠血清效价对比

3．8 讨论

3．9 本章小结

4 植物病毒偶联雌三醇单克隆抗体制备与鉴定

4．1 抗原

4．2 主要实验试剂

4．3 主要仪器

4．4 主要溶液的配置

4．4．1 细胞培养相关溶液的配置

4．4．2 抗体鉴定纯化相关溶液的配置

4．4．3 SDS-PAGE电泳相关溶液配置

4．5 实验方法

4．5．1 细胞融合

4．5．2 融合后阳性细胞株筛选

4．5．3 扩大培养及纯化

4．5．4 单克隆抗体透析

4．5．5 单克隆抗体的SDS-PAGE鉴定

4．5．6 抗体效价检测

4．5．7 抗体亚型鉴定

4．5．8 抗体的特异性鉴定

4．6 结果与分析

4．6．1 TMV和CPMV细胞融合结果

4．6．2 TMV和CPMV细胞融合后筛选结果

4．6．3 TMV-EPMK-μE3、CPMV-μE3、KLH-μE3、BSA-μE3细胞融合结果

4．6．4 TMV-EPMK-μE3、CPMV-μE3、KLH-μE3、BSA-μE3细胞筛选结果

4．6．5 抗体纯化与浓度测定

4．6．6 TMV和CPMV单抗效价

4．6．7 TMV-EPMK-μE3、CPMV-μE3、KLH-μE3和BSA-μE3单抗效价

4．6．8 单克隆抗体的SDS-PAGE鉴定

4．6．9 单克隆抗体亚型鉴定

4．6．10 单克隆抗体特异性鉴定

4．7 讨论

4．8 本章小结

结论

参考文献

附录

致谢

声明