黑龙江口岸城市啮齿类动物感染汉坦病毒的分子流行病学研究

摘要

汉坦病毒（Hantavirus，HV）是一种有包膜分节段的负链RNA病毒，属布尼亚病毒科。HV的自然宿主为啮齿类动物。其对啮齿类只造成一过性感染，并不影响其宿主的寿命和繁衍。但其可通过野生啮齿类宿主的排泄物如唾液、尿和粪便等感染人类，并引发两种严重的临床疾病:肾综合征出血热(hemorrhgic fever with renal syndrome，HFRS)和汉坦病毒肺综合症（hantavirus cardiopulmonary syndrome，HPS）。中国拥有世界上最高的HFRS发病率，而黑龙江是最严重的疫区之一。
　　进行疫病监测和流行病学研究，是有效防控疫病的重要基础。黑龙江省与俄联邦、蒙古等多国接壤，是动物疫病跨国传播的重要防控区域，而口岸地区人员、货物交流频繁，又会提升动物疫病传播的风险。开展口岸地区疫病监测和流行病学研究，尤其具有其重要性。因此，本研究对2014年黑龙江省主要口岸城市汉坦病毒在自然宿主中的流行情况进行了调查，并重点对从啮齿类动物体内分离的HV进行了分子流行病学研究。
　　本研究中，共在黑龙江地区选取12个口岸城市，捕获啮齿动物645只，其中主要为11种啮齿目动物，此外包括4只鼩鼱（Sorex araneus Linnaeus）。在捕获的啮齿目动物中，数量最多的是黑线姬鼠（Apodemus agrarius），其次是褐家鼠（Rattusnorvegicus）。对上述捕获的动物进行PCR检测以确定HV感染情况。结果表明黑线姬鼠中HV的有感染率是4.9％(14/282)，而褐家鼠的HV感染率是8.3％(15/180)。进一步完成的基于基因序列测定和遗传进化分析结果表明，分离到的HV中，包含两种HV基因型:汉滩病毒(Hantaan virus，HTNV)和汉城病毒(Seoul virus，SEOV)。其中HTNV有10株，SEOV有19株，SEOV感染的检出率略高于HTNV。而遗传进化树分析表明，黑龙江口岸地区流行的SEOV和HTNV各存在两个和一个进化分支，与之前报道的检测结果相一致，未检测到有新进化分支的出现。为了更好地了解在黑龙江口岸地区HV的流行情况，我们获得了一株分离于褐家鼠的TJ分离株(HTNV)的M序列全长和一株DN2分离株(SEOV)的全基因组序列，来分析其基因信息。其中，HTNV的M基因氨基酸序列与国内外参考毒株对比后，并未发现有重要氨基酸位点突变。而DN2分离株与国内外代表毒株SEOV L99的核苷酸同源率是:S基因96.5％，M基因98.3％，L基因96.0％。氨基酸序列的同源率为:S基因93.3％，M基因95.2％，L基因99.1％。
　　以上研究结果，支持目前黑龙江口岸地区鼠类动物感染的HV为SEOV和HTNV，而SEOV的感染率可能相对较高。全部研究数据的获得，有助于明确黑龙江地区特别是口岸地区啮齿类作为载体的HV的流行情况，为HV引发疾病的有效防控提供重要参考。

目录

摘要

1 绪论

1．1 课题背景

1．2 文献综述

1．2．1 汉坦病毒基因组结构

1．2．2 汉坦病毒的流行病学

1．2．3 汉坦病毒的致病机理

1．3 本研究的目的和意义

2 材料和方法

2．1 材料

2．1．1 宿主动物的采集

2．1．2 引物设计与合成

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要试剂配制

2．1．5 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 宿主动物的采集

2．2．2 鼠肺标本的获取和保存

2．2．3 肺脏组织RNA提取及RT-PCR

2．2．4 琼脂糖凝胶电泳鉴定及胶回收

2．2．5 连接转化及鉴定

2．2．6 核酸序列的测定

2．2．7 M基因的系统进化分析

2．2．8 DN2毒株基因全序列比对和系统进化分析

3 实验结果

3．1．1 宿主动物样本的采集说明

3．1．2 鼠肺样品的病毒基因型分型

3．1．3 鼠肺阳性样本M基因部分片段和TJ毒株M基因全长测序

3．1．4 DN2毒株S、M和L基因全长测序

3．1．5 SEOV M基因部分片段遗传多样性分析

3．1．6 HTNV分离株的M基因部分片段遗传多样性分析

3．1．7 SEOV和HTNV的分离株与HV原型毒株的系统进化分析

3．1．8 TJ毒株与多重HTNV M基因氨基酸序列的比对

3．1．9 SEOV DN2分离株全基因组序列扩增

3．1．10 HV DN2毒株S、M和L片段的基因特征分析

3．1．11 DN2毒株和其他SEOV参考毒株的系统进化分析

4 讨论

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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