东北茶藨子花发育B类MADS-box基因的克隆与表达分析

摘要

东北茶藨子(Ribes mandshuricum Maxim)为双子叶植物，蔷薇目，茶藨子科（Ribesiaceae），茶藨子属(Ribes L.)植物。茶藨子科植物，有单性花植物（雌雄异株）如双刺茶藨子，也有双性花植物如东北茶藨子，两种植物性别体系。B类MADS-box基因主要功能是调控花瓣和雄蕊的发育，前人有研究表明双刺茶藨子植物的雌雄花在生长发育不同阶段B类MADS-box基因的表达模式不同，为解释茶藨子属植物在性别决定过程中，B类MADS-box基因行驶的功能。本研究以野生东北茶藨子花为实验材料，应用RACE方法克隆得到3个MADS-box基因全长RdDAP3-1、RdDAP3-2、RdDPI，基于生物信息学方法对基因的氨基酸序列开展序列特征分析和系统进化分析。实时荧光定量PCR分析基因东北茶藨子和双刺茶藨子A类B类及C类MADS-box基因不同时期的表达模式，寻找两种不同性别的花在发育时期B类MADS-box基因的调控差异。本研究结果为深入阐释东北茶藨子MADS-box基因的作用机制和茶藨子属花性别发育的分子调控机理奠定了基础。
　　(1)应用RACE方法获得了包含完整开放阅读框的RdDAP3-1、RdDAP3-2、RdDPI的全长cDNA序列。
　　(2)为阐释克隆基因与已确认的MADS-box基因之间的同源性，利用生物信息学相关软件对3条基因的氨基酸序列进行了序列特征和系统发育分析。序列特征分析结果显示RdDAP3-1、RdDAP3-2和RdDPI基因的开放阅读框分别编码230、236、216和168个氨基酸，RdDAP3-1、RdDAP3-2、RdDPI的氨基酸序列都具有典型的MIKC型结构，多肽链的C末端分别含有B功能基因家族特有的基序。系统发育分析表明，RdDAP3-1、RdDAP3-2属于双子叶B功能基因家族AP3/DEF进化系的euAP3进化系，RdDPI属于基因PI/GLO进化系。
　　(3)东北茶藨子实时定量RT-PCR分析结果表明:RbDAP1基因表达量呈递减趋势，RbDPI和RbDAG基因从花发育初期到花完全开放表达量逐渐增加，RbDAP3基因从开花初期到花序生长前期表达量呈下降趋势，从花序生长后期到开花完全表达量上升并超过了第一阶段表达水平。RbDSVP基因在花发育过程中呈低水平表达。RbDAP3、RbDPI和RbDSVP基因在叶和叶柄中检测到表达。
　　(4)双刺茶藨子实时定量RT-PCR分析结果表明:雌雄花中的RdFAP1和RdMAP1基因在五个发育时期随着花发育完成表达量呈递减趋势;RdFAG和RdMAG基因和RdFPI和RdMPI基因随着花发育的完成表达量逐渐升高，PI基因在雄花中表达量较高，AG基因在雌花中表达量较高。RdFAP3基因在花蕾刚刚开放到花序生长中期两个阶段表达量上升，花序生长中期到花序生长完成阶段表达量下降，到花开放中期表达量有所回升，直到花全部开放表达量变化不大呈微弱的降低，五个时期中，花序生长前期表达量最高;RdMAP3基因在花序生长中期之前呈上升趋势，花序发育中期过后表达量逐渐减少，从花开放中期到花全部开放表达量显著增加并达到最高;与东北茶藨子相比较表达模式有明显差异的为PI基因，在东北茶藨子中表达量递减，在双刺茶藨子雌雄花中表达量递增。

目录

摘要

1 绪论

1．1 课题背景

1．2 被子植物花器官发育的分子基础

1．2．1 花器官的进化起源

1．2．2 花器官发育分子调控网络

1．2．3 花发育ABCDE模型

1．2．4 B类MADS-box功能基因

1．2．5 MADS-box蛋白的结构特征及四聚体模型

1．3 不完全花发育

1．3．1 植物性别体系

1．3．2 不完全花形成机制

1．3．3 不完全花形成途径

1．4 东北茶藨子对于花器官特征决定基因研究的价值

2 东北茶藨子MADS-box基因的克隆

2．1 植物材料

2．2 试验试剂

2．2．1 RNA提取试剂

2．2．2 RACE法克隆所用试剂

2．3 试验方法

2．3．1 东北茶藨子花总RNA的提取

2．3．2 mRNA的纯化

2．3．3 RACE反应的引物设计

2．3．4 东北茶藨子MADS-box基因3’RACE片段的扩增

2．3．5 东北茶藨子MADS-box基因5’RACE片段的扩增

2．3．6 目的片段的回收纯化

2．4 结果分析

2．4．1 东北茶藨子花总RNA的提取

2．4．2 东北茶藨子3’RACE PCR扩增结果

2．4．3 东北茶藨子5’RACE PCR结果

2．4．4 东北茶藨子MADS-box基因全长cDNA序列拼接结果

2．5 讨论

2．6 本章小结

3 东北茶藨子MADS-box基因的序列特征及系统进化分析

3．1 东北茶藨子MADS-box基因的序列特征分析

3．1．1 生物信息学分析

3．2 东北茶藨子功能基因的同源性分析与系统进化分析

3．2．1 RbDAP3基因序列结构

3．2．2 RbDPI基因序列结构

3．2．3 东北茶藨子B功能基因的氨基酸序列同源性分析

3．2．4 部分B功能MADS-box蛋白的系统进化分析

3．3 讨论

3．3．1 蛋白的基本性质

3．3．2 系统进化分析

3．4 本章小结

4 东北茶藨子MADS-box基因表达分析

4．1 试验材料

4．2 试验试剂盒仪器

4．3 试验方法

4．4 结果分析

4．4．1 东北茶藨子MADS-box基因时空表达差异半定量RT-PCR结果分析

4．5 讨论

4．6 本章小结

5 双刺茶藨子MADS-box基因表达分析

5．1 试验材料

5．2 试验试剂盒仪器

5．3 试验方法

5．4 结果分析

5．4．1 双刺茶藨子MADS-box基因实时定量结果分析

5．5 讨论

5．6 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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