烟青虫识别寄主植物挥发物的神经与分子机制

摘要

在长期的自然进化过程中，昆虫形成了一套特异而灵敏的嗅觉通讯系统。它们通过识别种内或种间性信息素以及自然界中的各种气味化合物来完成一系列重要的生命活动，如选择适宜的食物和产卵繁殖场所，寻找配偶，躲避和防御天敌等等。昆虫主要依靠其触角感受外界的气味化合物，触角上密布着大量的嗅觉感觉毛（即嗅觉感受器），可以将外界化学信号转换成电信号，并传递到昆虫更高级的中枢神经系统(Central nervous system，CNS)。所以阐明昆虫嗅觉感受的神经和分子机制，不仅可以对昆虫行为进行调控，还可以比较近缘物种间对外界化学分子识别机制的差异。本研究以烟青虫为研究对象，利用单细胞记录技术，根据对测试气味的不同反应，鉴定出雌蛾与雄蛾的毛形感器和锥形感器的不同功能亚型和多条可以被不同气味化合物激活的嗅觉受体神经元;并根据烟青虫转录组结果，克隆得到烟青虫多个气味受体，利用爪蟾卵母细胞异源表达系统结合双电极电压钳鉴定这些气味受体的功能;阐明识别气味化合物嗅觉通路，并通过Y型管行为学实验，测定气味分子对昆虫行为的影响，主要结果如下:
　　1、本研究选取了20种气味化合物，利用单细胞记录(Single Sensillum Recording，SSR)，鉴定得到烟青虫(Helicoverpa assulta)雌蛾与雄蛾的毛形感器和锥形感器功能亚型和多条嗅觉神经元。结果发现:在烟青虫雌蛾中鉴定出3种类型的毛形感器，即Type A(F-T-A)、Type C(F-T-C)和Type D(F-T-D)，共有8类嗅觉神经元。Type-A为最主要的感器类型，其中有一个神经元可被四种气味物质激活，且对A Chemical和水杨酸丁酯的反应最强烈。Type D类的反应谱较窄，只能被三种气味物质激活，其中一种是烟草挥发物橙花叔醇。烟青虫雌蛾的锥形感器分为4个功能类型:Type A(F-B-A)、Type B(F-B-B)、Type C(F-B-C)和Type D(F-B-D)，共有9类嗅觉神经元。烟青虫雄蛾毛形感器只有2种类型，Type A(M-T-A)和Type D(M-T-D)，共有6类嗅觉神经元。烟青虫雄蛾的锥形感器也具有4种类型，Type A(M-B-A)、Type B(M-B-B)、Type C(M-B-C)和Type D(M-B-D)，共有9类嗅觉神经元。雌蛾与雄蛾锥形感器的Type-A、Type-B和Type-C类型，对气味物质的反应完全相同，只有Type D反应不同。Type-D反应谱较宽，在雌蛾中，其可对10种气味物质有反应，而雄蛾仅对6种有反应。
　　2、克隆了烟青虫1个共受体Orco和9条普通气味受体基因(HassOrco，HassOR17,HassOR24,HassOR27,HassOR40、HassOR41,HassOR42,HassOR43,HassOR44、HassOR55)的全长序列，随后将9条气味受体基因分别与共受体Orco在爪蟾卵母细胞中进行体外共表达，然后结合双电极电压钳进行了功能研究。结果表明:HassOR27/Orco对水杨酸甲酯、顺-3-己烯醇、苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯和水杨酸甲酯有反应，且对水杨酸甲酯反应最强。HassOR42/Orco对苯乙醛反应强烈，但对苯乙醇和对羟基苯甲酸甲酯反应较小。HassOR43/Orco对苯甲酸甲酯、水杨酸甲酯和羟基苯甲酸甲酯反应均较小，但对甲氧基苯甲酸甲酯反应强烈。HassOR44/Oroc对甲氧基苯甲酸甲酯反应最大。HassOR40/Orco只能被三种气味物质激活，且对烟草挥发物橙花叔醇有反应。而HassOR17/Orco、HassOR24/Orco、HassOR41/Orco和HassOR55/Orco对供试气味均无反应。
　　3、利用单细胞记录技术在烟青虫雌蛾与雄蛾中，鉴定得到了一种可以感受橙花叔醇的毛形感器Type-D。该类感器中的b类神经元可被橙花叔醇激活，且也可被香叶醇和乙酸香叶酯激活。利用双电极电压钳发现HassOR40/Orco也只能感受这三种气味化合物。将受体与神经的研究结果进行对应，初步推断HassOR40在该神经元下表达，阐明烟青虫识别橙花叔醇的’0R-OSN’嗅觉通路。烟青虫与棉铃虫为近缘物种，但它们的寄主范围却不同。将烟青虫OR40与其近缘种棉铃虫OR40进行多序列比对，结果表明烟青虫和棉铃虫的OR40氨基酸序列一致性高达99.0％。通过对烟青虫成虫进行Y型管行为研究，发现橙花叔醇对雌蛾和雄蛾均有显著吸引作用。
　　通过以上一系列技术手段，从分子和外周神经的水平上阐明了烟青虫感受橙花叔醇的’OR-OSN’嗅觉通路，进而为近缘种间识别不同寄主提供理论基础，以及开发和应用更加经济高效、环境友好的控制技术来防治此类害虫。

目录

摘要

1 绪论

1．1 植物挥发物种类及其作用

1．2 昆虫嗅觉识别机制

1．2．1 棉铃虫与烟青虫触角感器类型

1．2．2 昆虫触角对气味分子的识别机制

1．3．1 昆虫气味受体的结构特征

1．3．2 昆虫气味受体的鉴定

1．3．3 昆虫气味受体的功能研究

1．4 鳞翅目昆虫嗅觉受体神经元的研究

1．5．1 立题依据

1．5．2 研究内容

2 烟青虫感知寄主植物挥发物的嗅觉感器及其神经元鉴定

2．1 引言

2．2 材料方法

2．2．1 供试昆虫

2．2．2 主要试剂及仪器设备

2．2．3 单细胞记录

2．3 结果与分析

2．3．1 烟青虫雌蛾嗅觉感器对寄主植物挥发物的反应

2．3．2 烟青虫雄蛾嗅觉感器对寄主植物挥发物的反应

2．4 本章小结

3 烟青虫普通气味受体功能鉴定

3．1 引言

3．2 材料方法

3．2．1 供试昆虫

3．2．2 主要试剂及仪器设备

3．2．3 总RNA提取

3．2．4 第一链cDNA的合成

3．2．5 各类引物的设计

3．2．6 目的基因的PCR克隆及测序

3．2．7 表达载体构建、cRNA合成

3．2．8 烟青虫的OR功能鉴定

3．3．1 烟青虫OR基因的克隆与序列分析

3．3．2 HassOR27的功能研究

3．3．3 HassOR40的功能研究

3．3．4 HassOR42的功能研究

3．3．5 HassOR43的功能研究

3．3．6 HassOR44的功能研究

3．3．7 HassOR17，HassOR24，HassOR41和HassOR55的功能研究

3．4 本章小结

4 烟青虫对一种烟草挥发物的嗅觉识别研究

4．1 引言

4．2．1 供试昆虫

4．2．2 主要试剂及仪器设备

4．2．3 总RNA提取

4．2．4 第一链cDNA的合成

4．2．5 各类引物的设计

4．2．6 目的基因的PCR克隆及测序

4．2．7 表达载体构建与cRNA合成

4．2．8 供试气味化合物

4．2．9 烟青虫对烟草挥发物的Y型管行为反应测定

4．3 结果与分析

4．3．1 烟青虫与棉铃虫的OR40基因克隆与序列分析

4．3．2 烟青虫感受橙花叔醇的嗅觉受体神经元鉴定

4．3．3 烟青虫对橙花叔醇的行为反应

4．4 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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