TTV抗原ORF1的基因克隆及原核表达

摘要

研究背景及目的：肝炎是一种严重危害人类健康的传染病，目前已发现和确认的肝炎病毒有甲、乙、丙、丁、戊、庚型。1997年底日本学者运用代表性差异技术从一名非甲－庚型肝炎病人(TTV)的血清中发现了输血传播病毒(TTV)。TTV基因组为单股线状DNA，目前己测定的核苷酸序列长约3.8kb，有两个开放读码框架(ORF)，ORFl位于该基因组的589-2898位核苷酸，编码770个氨基酸，ORF2位于107-712位核苷酸，编码202个氨基酸；ORFl可能编码病毒的结构蛋白，ORF2可能编码病毒的非结构蛋白；可以通过垂直传播，生物学特征与某些动物单链DNA病毒(微小病毒B19)相似。TTV的基因分型从已报道的TTVDNA部分基因序列来看，TTVDNA具有高度变异性，采用聚合酶链反应(PCR)检测血清TTVDNA是诊断TTV感染的主要手段。目前还未证实TTV感染引起肝损伤和影响肝功能，但TTV可引起ALT升高，出现病毒血症，并且在局部地区爆发性流行，同时TTV常和HBV及HCV共同感染。TTV在非甲至非庚型肝炎患者中的感染率较高，可能是非甲至非庚型肝炎的主要致病因子，现国内对TTV的研究资料还很缺乏，本实验的意义在于将TTV-ORFlDNA构建原核表达载体并获得高效表达，为TTV的ELISA检测和疫苗的抗原研究提供基础。 方法：从TTV病毒感染者外周血中提取DNA，用PCR从中扩增出目的基因，酶切PCR扩增产物并进行纯化获得TTV—ORFlDNA，插入载体pGEM—TEasy中，转化JMl∞感受态细菌中，随受体菌的生长繁殖，重组DNA分子得以复制扩增；运用pGEM—TEasy载体克隆鉴定引物T7／SP6对连接的准确性进行鉴定，从而确定阳性克隆，且进行DNA测序，以确保克隆的靶基因的正确性；pGEX一4T—l载体转化感受态细菌JMl∞并进行质粒纯化，双酶切质粒，回收0FRl目的片段和开环pGEX-4T．1质粒，将载体和目的基因连接，转化BL2l，以T1／T2特异性引物进行PeR扩增，鉴定重组目的片段的重组质粒，融合蛋白pGEX-4T．1．ORFl经IPTG诱导表达，并经12％SDS-PAGE凝胶电泳，考马斯亮蓝染色及Westernblot鉴定表达情况。 结果： 1．目的基因扩增及酶切鉴定：以引物P1、P2扩增TTV阳性血清，得到600bp的目的基因。PCR扩增产物经EcoRI酶切，可将目的基因切成383bp和217bp两个片段，与预期结果一致。 2．克隆和亚克隆重组子结果鉴定：目的基因插入载体pGEM—TEasy中，转化JMi09，蓝白筛选后选择7个菌落以T7／SP6为引物进行PCR扩增，5个为阳性克隆，2个为阴性克隆。以T1／T2为引物用PeR扩增法筛选鉴定重组体pGEX-4T—IORFl，转化BL21，以T7和SP6为引物序测定和分析。质粒中目的基因与GenBank公布的TTV基因序列进行同源性比较，结果在设计目的基因区(589一1188)与NC002076对应区域基因完全同源。 3．pGEX-4T—l—ORFl融合蛋白的诱导表达：转化有pGEX-4T-l-ORFl的BL21经IPTG诱导表达，并经12％SDS-PAGE凝胶电泳，考马斯亮蓝染色及Westernblot鉴定，证明了融合蛋白的成功表达。 结论：本实验利用分子生物学方法，成功获得TTV一0RFlDNA，构建得原核表达载体并诱导其在宿主菌内获得高效表达。通过此项研究，为TTV的ELISA检测和疫苗提供抗原。

目录

文摘

英文文摘

郑重声明

1前 言

2实验材料

3.实验方法

4.结 果

5.讨论

6.小 结

参考文献

TTV及其研究进展

英文缩写词表

致谢