耳鸣动物模型的建立及耳鸣大鼠听皮层可塑性的研究

摘要

一、背景与目的 耳鸣是在无外界相应声源刺激时耳内有响声的一种主观感觉，发病率极高。文献报告，持续性耳鸣患者约占总人口的l0％，其中，大约有1％～3％的人群因耳鸣而严重影响正常工作和生活。可见，耳鸣引起的痛苦和烦恼有时比耳聋更大。因此，耳鸣受到越来越多的重视，已成为临床上迫切需要解决而又难以解决的顽症之一。由于缺少合适的动物模型，以往对耳鸣的研究多局限于人类，这大大限制了对耳鸣机制的深入了解。自从发现大剂量水杨酸钠类药物能引起人类耳鸣后，在动物体内注射大剂量的水杨酸钠就成为研究耳鸣机制的主要方法。由于无法判断注射水杨酸钠后动物是否真的感受到了耳鸣，最早期的研究只是建立在推测的基础上。1988年Jastrebogff等按照巴甫洛夫条件反射原理，通过对大鼠行为学的观察，证实了注射水杨酸钠后的大鼠确实感受到了耳鸣，并由此建立了现今广为应用的耳鸣动物行为学模型。这一模型的建立大大促进了对耳鸣机制的研究，但先前的研究多局限在水杨酸钠的外周耳毒性方面，近年来水杨酸钠的中枢效应逐渐引起了学者们的注意。研究表明水杨酸钠能引起动物听觉通路上神经元电活动的一系列改变，同时，在对耳鸣患者的研究中也发现了听皮层神经元代谢活动的增加和功能重组的证据。因此，听觉中枢特别是听皮层功能活动的变化可能在耳鸣的产生中具有更为重要的作用。已经证明，中枢神经系统功能活动的变化能够通过c-fos基因的表达来反映。作为快反应基因，c-fos往往在静止细胞受到各种刺激时迅速表达，被认为是对外界刺激一转录耦联的信息传递过程中起着核内第三信史的重要作用，虽然其具体作用还不很清楚，但已证实新颖的感觉刺激或神经元的异常电活动可以导致中枢相应功能区c—fos基因表达的增多，现普遍认为c-fos基因的表达与中枢神经系统的功能可塑性有关。同时，近来的研究表明，大鼠听皮层的正常发育与N-甲基-D-天冬氨酸(N-Methyl-D-Aspartate，NMDA)受体亚型NMDR2A(NR2A)的表达升高有关，作为哺乳动物中枢神经系统主要的兴奋性递质谷氨酸的受体，NMDA受体的活化与神经元的放电紧密相关，并被认为无论在幼年或成年动物神经系统的突触可塑性中都发挥着重要作用。而且，许多学者认为与耳鸣的发生有着相似病理学基础的患肢痛的发病机理涉及了NMDA受体的激活与皮层功能的重组。因此，我们认为可以将c—fos与NR2A的表达作为听皮层神经元功能可塑性的标记物对耳鸣的中枢机制进行研究。本研究的目的：1．参照Jastreboff等创立的经典耳鸣动物行为学模型并适当改进，建立耳鸣动物模型；2．在造模前后对大鼠进行听觉脑干反应(ABR)检测，以筛选动物并探讨水杨酸钠引起的ABR变化及其意义；3．以c—fos和NR2A为标记，探讨听皮层的可塑性变化及其与耳鸣发病机理的关系。 二、材料与方法 本实验分为三部分。第一部分：耳鸣动物行为学模型的建立。按照Jastreboff等创立的耳鸣动物行为学模型的基本原理，在方法学上适当改进，建立耳鸣动物模型。选用健康、耳廓反应灵敏、无中耳感染、ABR测试反应阈小于42dBpeSPL、体重250～300克的Wistar大鼠30只，随机分为五组，每组6只。I组：水杨酸钠1组。从条件反射建立前开始于每次条件反射训练前3小时注射lO％水杨酸钠溶液(350rug／Kg．bw)，直至实验结束。Ⅱ组：水杨酸钠2组。从条件反射建立后开始于每次条件反射训练前3小时注射10％水杨酸钠溶液(350mg/Kg．bw)，直至实验结束。Ⅲ组：生理盐水1组。从条件反射建立后开始于每次条件反射训练前3小时注射同体积生理盐水溶液，直至实验结束。Ⅳ组：生理盐水2组。与以上三组共同饲养于有持续背景白噪声刺激的环境中，并于相同时间段内注射同体积生理盐水溶液，但不进行条件反射训练、不限水。V组：空白对照组。生活于安静环境中不进行条件反射训练、不限水、不注射药物。将经过限制饮水后的I、H、III组动物置于有持续背景白噪声的隔声室内，以背景白噪声的停止为条件刺激，电击为非条件刺激，将条件刺激出现前、后各lmin内动物的舔水时间(分别记为A和B)作为行为学观察指标进行条件反射训练，使动物形成“背景噪声停止一舔水减少”的条件反射，用R值(R=B/A+B)即舔水抑制率下降的程度反映动物条件反射的建立情况。当R值稳定在0．2或以下时，说明动物已经建立了稳定的条件反射，此时进入条件反射消退期，即在背景噪声关闭后不再给予电击，用R值的回复反映动物条件反射消退的情况，观察各组动物条件反射消退时间的差异，以判断动物是否感受到耳鸣。第二部分：水杨酸钠致耳鸣大鼠ABR改变的实验观察。用10％水合氯醛(4ml／Kg．bw)腹腔注射麻醉，保持肛温38*(2，以短声为刺激声，在实验前及处死前分别对每只动物进行^BR测试。从90dBpeSPL开始，lOdBpeSPL逐次递减，测定其ABR反应阈值及90dBpeSPL时各波潜伏期，以筛选实验动物并探讨水杨酸钠对大鼠ABR的影响及意义。第三部分：耳鸣大鼠听皮层可塑性的研究。以c-fos及NR2A为听皮层神经元功能可塑性标记探讨耳鸣大鼠听皮层的可塑性变化及其与耳鸣发生的关系。在条件反射的消退期，于最后一次注射药物后3小时，用10％水合氯醛腹腔注射深度麻醉后，经心脏灌注固定处死，Ⅳ、V组动物在相同的时间段内用同样的方法处死。切取含听皮层的脑组织进行免疫组织化学染色，在显微镜下观察c-fos及NR2A在各组动物听皮层中的表达。所得实验数据用SPSSiO.0软件进行统计学处理。 三、结果： 第一部分 l.在条件反射训练前，各组大鼠的舔水时间在背景噪声关闭前后未发生大的改变，R值维持在0．5左右。 2.在条件反射训练期，随着训练次数的增加，各组大鼠在背景噪声关闭后的舔水时间较关闭前明显减少，R值逐渐下降，最后均维持在0．2或以下。 3.在条件反射减退期，各组大鼠在背景噪声关闭后的舔水时间逐渐增加，R值逐渐回复至0．5左右，其中Ⅰ组所用时间最长，Ⅱ组最短，Ⅲ组居中。 第二部分 1.正常大鼠ABR波形稳定，包含5个波(分别标为I—V)，II波为主。以Ⅱ波的出现为标准，所得全部实验大鼠^BR的平均反应阈为37．08+3．34dBpeSPL，90dBpeSPLH波潜伏期为2．015+0．134ms。 2.经多次注射水杨酸钠后，I、Ⅱ组大鼠ABR波形分化较差，各波振幅下降，ABR反应阈值上升、Ⅱ波潜伏期延长与实验前相比具有统计学意义。 第三部分 1c-fos在各组大鼠听皮层中的表达：Ⅰ、Ⅱ组>Ⅲ、Ⅳ组>Ⅴ组，差异均具有统计学意义；而I、H组之间、Ⅲ、Ⅳ组之间的差异均无统计学意义。 2NR2A阳性神经元在Ⅰ、Ⅱ组大鼠听皮层中的表达显著高于Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组，差异具有统计学意义；而Ⅰ、Ⅱ组之间、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组之间的差异均无统计学意义。 四、结论： 1.用行为学方法证实了注射水杨酸钠致大鼠耳鸣的动物模型造模成功。 2.注射水杨酸钠能导致大鼠fiBR波形紊乱，反应阈值升高，Ⅱ波潜伏期延长；ABR检测能为水杨酸钠的耳毒性提供客观的听力学证据。 3.耳鸣大鼠听皮层中c-fos、NR2A表达的增多反映了听皮层的功能可塑性变化，同时也表明听皮层中相关神经递质及其受体可能参与了耳鸣的发生。

目录

文摘

英文文摘

郑重声明

引言

第一部分耳鸣动物行为学模型的建立

第二部分水杨酸钠致耳鸣大鼠ABR改变的实验观察

第三部分耳鸣大鼠听皮层可塑性研究

结论

参考文献

综述水杨酸导致耳鸣机制的研究进展

附录硕士研究生期间正式发表的论文

致谢