锂剂对新生鼠缺氧缺血性脑损伤的神经保护作用及其机制

摘要

背景和目的
　　 围产期窒息引起的缺氧缺血性脑损伤是导致儿童死亡和伤残的主要疾病之一，目前的治疗主要是支持与对症疗法，维持生命体征的稳定。近年来，虽然临床对照实验证实亚低温和促红细胞生成素治疗能够改善缺氧缺血性脑损伤患儿的预后，降低伤残率。但是由于缺氧缺血性脑损伤的发病机制复杂，涉及多个方面，针对某一发病机制的治疗措施疗效有限，脑损伤患儿的伤残率仍然较高，因此，探索新的有效的新生儿脑损伤的治疗措施仍然是研究的重点。
　　 锂元素发现于1817年，自1970年以来锂剂被认为是治疗精神分裂症的有效药物。新近的体内和体外的研究显示，锂剂能够抑制神经细胞死亡，具有神经保护作用。大量的证据也表明，锂剂的治疗对成年动物脑损伤模型具有保护作用，但对未成熟大脑损伤是否有神经保护作用尚未见报道。本研究采用新生鼠缺氧缺血性脑损伤动物模型，评价锂剂治疗对未成熟脑损伤的作用以及可能的机制。
　　 材料和方法：
　　 新生9日龄雄性Wistar大鼠，经异氟醚吸入麻醉，颈部正中偏左切开皮肤并分离左侧颈总动脉，丝线双结扎并从中间剪断，缝合皮肤后放回母鼠笼恢复1个小时，而后将其放入充有湿化含氧7.8％氮氧混合气的36oC恒温箱中50分钟即制成脑缺氧缺血模型。脑缺氧缺血模型制成后立即给予氯化锂2 mmol/kg腹腔注射，间隔24小时后重复注射氯化锂1 mmol/kg。在脑缺氧缺血后6小时，24小时和72小时处死后经心脏灌注4％的副醛固定，去脑进行石蜡包埋，冠状全脑连续切片，厚度为5μm，用于微管相关蛋白2(micortubular associatedprotein-2，MAP2)，激活的半胱天冬酶3(activated caspase-3)，凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor.AIF)，细胞色素C(cytochrome c)，胞衬蛋白降解产物(fodrin breakdown product，FBDP)以及微管相关蛋白2轻链3(microtubularassociated protein-2，light chain-3，LC3)的免疫组化染色，或者直接断头处死后快速分离左右大脑皮层和纹状体，加入冰冷的匀浆缓冲液手工匀浆，采用密度梯度离心分离细胞浆，细胞核以及线粒体成分，进行酶活性测定或者蛋白印迹检测。
　　 结果：
　　 在缺氧缺血后72小时对脑损伤的程度进行评估，通过MAP2免疫组化染色并计算脑梗塞体积，脑萎缩体积以及脑各部位的病理积分进行综合评估。结果发现，锂剂治疗组(n=28)的脑梗塞体积为13.8±3.3 mm3，较对照组(n=28)的脑梗塞体积24.7±2.9 mm3减少44.1％(P<0.05)，而脑萎缩的体积在锂剂治疗组为24.8±3.3 mm3，较对照组的脑萎缩体积42.4±2.4 mm3减少41.5％(P<0.001)，并且锂剂治疗组在多个区域，包括大脑皮质(P<0.05)，海马(P<0.01)，丘脑(P<0.001)和纹状体(P<0.01)的脑损伤程度均较对照组明显减轻。
　　 磷酸化的糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)是糖原合成酶激酶-3β的无活性形式，活化的糖原合成酶激酶-3β能够促进细胞的死亡。在锂剂治疗后6小时，损伤侧大脑皮层磷酸化的糖原合成酶激酶-3β的含量明显高于对照组损伤侧的含量(P<0.05)。细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinases，ERK)具有促进细胞存活的作用，磷酸化的ERK是其活性形式，锂剂治疗后6小时损伤侧磷酸化ERK的含量明显高于对照组损伤侧的含量(P<0.05)。
　　 胞衬蛋白是细胞的骨架蛋白，同时也是钙依赖蛋白酶(calpain)和半胱天冬酶(caspase)的底物，前者能使胞衬蛋白降解为150kDa的降解产物(FBDP)，后者能使胞衬蛋白降解为120kDa的降解产物，锂剂治疗组胞衬蛋白的降解明显减少，同时FBDP免疫组化染色的阳性细胞的数量也明显减少，提示锂剂能够抑制calpain的激活。
　　 caspase-3阳性细胞数量及caspase-3的活性测定结果显示，在锂剂治疗后6小时较对照组低，但无统计学差别。在锂剂治疗后24小时活性较对照组明显降低(P<0.001)，免疫蛋白印迹的结果也显示caspase-3的酶原降解变成激活的caspase-3在锂剂治疗后明显受抑制，活性caspase-3的免疫组化染色显示caspase-3阳性细胞的数量在锂剂治疗后24小时的海马区域下降最明显(P<0.05)。
　　 细胞色素C存在于正常细胞的线粒体膜腔隙中，在损伤因素作用下由线粒体释放到胞浆，通过激活caspase-3引起细胞死亡，蛋白印迹定量的结果显示线粒体中细胞色素C的释放随缺氧后恢复时间的延长而增加，但是锂剂治疗能降低细胞色素C的释放，尤其在缺氧缺血后24小时最明显(P<0.05)，细胞色素C免疫组化染色的阳性细胞数在锂剂治疗后24小时明显低于对照组(P<0.05)。
　　 AIF存在正常细胞的线粒体膜腔隙中，在损伤因素作用下由线粒体释放到胞浆并跨膜转移到细胞核导致DNA断裂，蛋白印迹定量的结果显示线粒体中AIF的释放随缺氧后恢复时间的延长而增加，但是锂剂治疗能降低AIF的释放，尤其在缺氧缺血后24小时最明显(P<0.05)，AIF免疫组化染色的阳性细胞数在锂剂治疗后24小时海马区域明显低于对照组(P<0.05)。
　　 胞浆中出现点状LC3染色是自吞噬的标志，在缺氧缺血后LC3的阳性细胞数增加，锂剂治疗后LC3的阳性细胞数量减少，尤其是在缺氧缺血后72小时最明显(P<0.001)。
　　 结论：
　　 1.锂剂对新生鼠缺氧缺血性脑损伤有神经保护作用
　　 2.锂剂能够抑制GSK-3β而激活ERK
　　 3.锂剂能够抑制calpain和caspase-3的激活
　　 4.锂剂能够抑制AIF和细胞色素C从线粒体释放
　　 5.锂剂能够抑制自我吞噬

目录

文摘

英文文摘

中英文缩略词对照表

1 引言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

5 结论

参考文献

综述

参考文献

致谢

附图

个人简历 在学期间发表的学位论文与研究成果