多重巢式PCR同步检测HBV、HCV和HIV-1方法的建立

摘要

背景
　　 随着分子生物学技术的发展和对可致人类疾病的病毒认识的不断加深,不断发现新的病毒,尤其是经输血传播性病毒占有举足轻重的地位,而乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和人类免疫缺陷病毒(HIV)成为目前威胁血液安全的主要因素。为了保证输血的安全性,各国依据各自国情,确定相应的检测项目和方法,对血液进行筛检。
　　 我国《献血者健康检查标准》中规定:用酶标法(ELISA)检测乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒抗体(HCV抗体)和艾滋病病毒抗体(HIV抗体)。但由于ELISA存在较长“窗口期”、病毒变异、免疫静默感染(immunosilentinfection)以及人工操作错误等因素的影响,经输血传播病毒感染依然存在。而ELISA的“窗口期”漏检成为当前影响血液安全性进一步提高的瓶颈,单纯检测抗原或抗体来筛选献血者不能有效地保障血液安全。
　　 以PCR为代表的核酸检测技术(nucleic acid test,NAT)是一种新的经输血传播疾病的检测方法,敏感性高,能检测出标本中极其微量的核酸,甚至在病毒感染后数天即能检出,大大缩短了“窗口期”,还能检测出ELISA漏检的被感染血液。尽管NAT从理论上并不能完全消除感染“窗口期”,但病毒核酸转阳之前的血液传染性非常低,可以有效地控制经输血传播病毒性疾病。
　　 将PCR作为血液常规筛查的方法,存在多方面的问题。为降低成本,在保证灵敏度的前提下,往往采取血浆池策略(MP-NAT)。但是,血浆池的样本数越多,核酸扩增的检测灵敏度越低。另一个更好的方法是采用多重PCR。这不仅能节省珍贵的实验样品,而且能使多次常规PCR通过一次多重PCR就能实现。与常规PCR相比,多重PCR影响因素更多。因此,必须反复优化反应条件。
　　 目的
　　 本研究的设计立足于整体,构建一种快速、经济、实用、可靠的同步检测HBV、HCV和HIV-1的方法,既能有效地保证输血安全,又能降低成本。
　　 材料与方法
　　 1.标本来源:主要来自于河南省郑州大学第一附属医院感染性疾病科检验室和河南省某村经血源性传播HIV的感染者。
　　 2.病毒核酸提取方法的选择:先用病毒DNA/RNA快速纯化试剂盒提取HBVDNA/HCV RNA,确定单独扩增的巢式PCR反应条件。然后以3种不同的核酸提取方法所提取的HBV DNA/HCV RNA为模板,以已确定的扩增条件反应,比较其结果,从而确定一种快速、经济、实用的病毒核酸提取方法。
　　 3.确定同时扩增HBV DNA和HCV RNA的条件:以所确定的核酸提取方法同时提取HBV DNA和HCV RNA,确定同步扩增的多重巢式PCR条件。
　　 4.确定同时扩增HBV DNA、HCV RNA和HIV-1 RNA的条件:在确定扩增HIV-1 RNA反应条件的基础上,探索同时检测HBV、HCV和HIV-1的多重巢式PCR的反应条件。
　　 结果：
　　 1.通过用试剂盒、TRIzol、Catrimox-14、病毒裂解液这4种不同核酸提取试剂的比较,发现用TRIzol效果最好,用试剂盒与病毒裂解液的效果相当,用Catrimox-14的结果较差。但是用TRIzol提取时需低温离心,且费时较长,不适宜常规开展；试剂盒价格昂贵；Catrimox-14法仍需改进；用病毒裂解液提取核酸的方法可作为同时提取病毒DNA和RNA的方法。
　　 2.用多重巢式PCR同时扩增HBV DNA和HCV RNA时,第一次扩增HBV占优势,HCV和HBV的引物浓度比例按2:1；第二次扩增,片段较小的HCV占优势,HCV和HBV的引物浓度比例按1:2。
　　 3.用多重巢式PCR同时扩增HCV RNA、HBV DNA和HIV-1 RNA时,第一次扩增,HCV、HBV和HIV-1的引物浓度比例按2:1:4,第二次扩增时按1:2:4加入反应体系,才能保证片段较长的HIV-1得到有效扩增。
　　 结论：
　　 1.用配制的裂解液同时提取HBV DNA、HCV RNA和HIV-1 RNA是可行的。
　　 2.多重PCR时,降低扩增效率高的片段的引物的量比增加扩增效率低的片段的引物的量更有助于提高扩增效率低的片度的扩增产物的量。
　　 3.本研究所探索的方法可同时检测HBV、HCV和HIV-1,但其灵敏度和特异度需进一步鉴定。

目录

文摘

英文文摘

图和附表清单

中英文缩略词对照表

1 引言

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 实验方法

2.3 实验室质量控制方法

3 结果

3.1 单项PCR反应条件的确立

3.2 巢式PCR反应条件的确立

3.3 多重巢式PCR检测HBV、HCV反应条件的确立

3.4 不同提取方法的比较

3.5 多重巢式PCR检测HBV、HCV和HIV-1反应条件的确立

4 讨论

4.1 多重巢式PCR的应用

4.2 多重PCR的关键要素

4.3 核酸提取方法的选择

4.4 本研究进一步的方向

5 结论

参考文献

综述

参考文献

个人简历、攻读硕士期间发表的论文

致谢