熊果酸对人舌癌Tca8113细胞增殖、凋亡的影响及机制的实验研究

摘要

口腔癌是最常见的十大恶性肿瘤之一,而在我国口腔癌中,舌癌的发病率居第一位。舌癌生长快,恶性程度高,浸润性较强。治疗方法常是手术、放疗、化疗等的综合治疗,但患者的五年生存率仍然很低,探寻积极有效的预防途径及有效的治疗药物显得十分迫切和必要。
　　 熊果酸对多种致癌、促癌物有抵抗作用。体外实验证实其可以抑制多种肿瘤细胞的增殖、诱导其凋亡。而熊果酸对口腔肿瘤的作用研究较少,而其对舌癌作用机制的研究,国内外尚不多见。
　　 采用体外培养人舌癌Tca8113细胞的方法,观察熊果酸对其产生的作用。在此基础上,采用MTT法,流式细胞术、电镜观察、免疫细胞化学技术、及RT—PCR、Western Blot等多种分子生物学技术观察熊果酸对Tca8113细胞增殖、凋亡的影响并探讨其发生机制。在体外实验的基础上,以Tca8113细胞株建立人舌癌裸鼠皮下移植瘤模型,应用适当浓度的熊果酸进行治疗,观察熊果酸经体内代谢后对肿瘤的影响以及荷瘤裸鼠的毒性反应,并探讨其发生机制,为舌癌的治疗寻找新的药物,拓展新的思路和方法,为熊果酸在口腔癌治疗中的开发、应用提供实验依据。本研究分为以下三个部分:
　　 方法:
　　 1.光学显微镜观察未经和经熊果酸作用的Tca8113细胞的形态学变化。
　　 2.经浓度为6.25、12.5、25、50μmol／L熊果酸培养液作用于人舌癌Tca8113细胞,分别培养12、24、36、48、60、72h后,采用四甲基偶氮唑蓝(methylthiazolyl terazolium,MTT)比色法,检测Tca8113细胞增殖活性的改变,观察不同浓度熊果酸作用不同时间后对人舌癌Tca8113的毒性效应。
　　 3.将浓度25μmol／L熊果酸培养液作用于人舌癌Tca8113细胞,分别培养0、24、48、72h后,应用流式细胞术(Flow Cytometer,FCM)在功能水平上检测人舌癌Tca8113细胞的凋亡率及细胞周期分布情况。
　　 4.应用透射电镜观察经25μmol／L熊果酸作用72h的细胞超微结构变化
　　 5.统计学处理:采用统计学软件SPSS13.0对数据进行统计学处理。数据用均数±标准差((x)±s)表示。MTT法检测结果采用两因素方差分析,流式细胞术结果采用单因素方差分析,检验水准α=0.05。
　　 结果:
　　 1.经熊果酸作用后的Tca8113细胞发生了形态学变化。
　　 2.熊果酸对Tca8113细胞有明显的生长抑制作用,呈现明显的浓度依赖性和时间依赖性；不同浓度组间、不同时间组间生长抑制率均有显著性差异(P<0.01)。50μmol／L熊果酸作用72h后细胞生长抑制率达68.80％。
　　 3.流式细胞术结果显示,随熊果酸作用时间延长,Tca8113细胞凋亡率由2.57％增加至24.51％,有统计学意义(P<0.01)。G2／M期细胞比例变化不明显(P>0.05),而S期细胞比例逐渐降低(P<0.01),G0／G1期细胞比率明显升高(P<0.01)。
　　 4.透射电镜显示熊果酸作用后,细胞骨架破坏,核染色质浓缩成块,同时可见凋亡小体。
　　 方法:
　　 1.分别制作经浓度25μmol／L熊果酸作用0、24、48、72h的细胞爬片,采用免疫细胞化学技术检测细胞NF-κB、VEGF、bcl-2和Bax基因蛋白表达情况。
　　 2.将25μmol／L熊果酸作用于人舌癌Tca8113细胞0、24、48、72h后,应用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription—polymerase chainreaction,RT—PCR)技术检测药物作用后的Tca8113细胞中NF—κB、VEGF、bcl-2和Bax的mRNA表达情况,并对检测结果进行半定量分析,以期了解熊果酸抑制舌癌细胞增殖及其促其凋亡的机制。
　　 3.将25μmol／L熊果酸作用于人舌癌Tca8113细胞0、24、48、72h后,采用Western Blot方法检测药物作用后的Tca8113细胞中NF-κB、VEGF、Bcl-2和Bax基因蛋白表达情况,并对检测结果进行半定量分析,进一步研究熊果酸抑制舌癌细胞增殖及其促其凋亡的机制。
　　 4.统计学处理:应用SPSS13.0统计软件对数据进行统计学处理。数据用均数±标准差((x)±s)表示,采用单因素方差分析。检验水准α=0.05。
　　 结果:
　　 1.免疫细胞化学染色结果:NF-κB棕黄色着色在细胞核和细胞浆内；VEGF棕黄色着色在细胞质内；Bcl-2、Bax棕黄色颗粒在细胞质内。
　　 2.RT-PCR结果:经熊果酸作用后,Tca8113细胞的NF-κB、VEGF、Bcl-2基因mRNA表达逐渐降低,Bax细胞因子mRNA表达逐渐升高,Bcl-2／Bax比例降低,且有时间依赖性。有统计学意义(P<0.05)。
　　 3.Western blot检测结果:经熊果酸作用后,Tca8113细胞的NF-κB、VEGF、Bcl-2基因蛋白表达逐渐降低,Bax蛋白表达逐渐升高,且有时间依赖性。有统计学意义(P<0.05)。
　　 方法:
　　 1.选用4-6w龄的BALB／C-nu／nu雌性裸小鼠12只,在其腋部皮下接种Tca8113细胞,建立裸鼠移植瘤模型。成瘤后随机分为对照组和实验组,每组6只,实验组每d向肿瘤组织局部注射熊果酸,剂量为0.05mg／g体质量；对照组注射同体积PBS(0.01M,pH7.4)。共治疗4w。
　　 2.每d观察裸鼠的精神、饮食及活动状况。每w测量瘤体大小及裸鼠体重,进行药物毒性评价。
　　 3.治疗结束时处死小鼠,剥除肿瘤称重,计算抑瘤率。
　　 4.光学显微镜下观察肿瘤组织及脑、心、肝、脾、肾等重要脏器。
　　 5.应用RT—PCR技术检测移植瘤中NF—κB、VEGF、bcl-2和Bax的mRNA表达情况,并对检测结果进行半定量分析,以期了解熊果酸抑制舌癌细胞移植瘤机制。
　　 6.采用Western Blot方法检测移植瘤中NF-κB、VEGF、Bcl-2和Bax基因蛋白表达情况,并对检测结果进行半定量分析,进一步研究熊果酸抑制舌癌细胞移植瘤增殖及其促其凋亡的机制。
　　 7.采用TUNEL法检测移植瘤细胞凋亡情况,统计细胞凋亡指数。
　　 8.统计学处理:采用SPSS13.0统计软件对数据进行统计学处理。数据用均数±标准差((x)±s)表示。裸鼠体质量变化及瘤体质量变化分别采用独立样本的t检验和配对t检验。RT—PCR及Western Blot采用单因素方差分析。检验水准α=0.05。
　　 结果:
　　 1.与对照组相比,实验组肿瘤生长缓慢,随注射熊果酸时间增长,肿瘤被抑制效果更加明显。到治疗结束时,两组裸鼠移植瘤体积、瘤质量均存在显著性差异(P<0.05)。瘤质量及瘤体积抑制率达到55.65％和61.72％。
　　 2.治疗过程中,裸鼠未见明显不良反应,治疗结束时,各组裸鼠体质量与治疗前体质量相比增加平稳,比值大于0.8,未见明显毒性反应。两组裸鼠的重要脏器脑、心、肝、脾、肾等均未见器质性改变及瘤转移等。
　　 3.光学显微镜下,实验组肿瘤内组织坏死崩解的面积明显大于对照组,细胞形态的异形性比对照组小,可见核固缩等凋亡现象。
　　 4.RT—PCR技术检测移植瘤中NF—κB、VEGF、bcl-2 mRNA表达下调,Bax mRNA表达上调,有统计学差异(P<0.05)。
　　 5.Western Blot方法检测移植瘤中NF—κB、VEGF、Bcl-2基因蛋白下调,Bax基因蛋白表达上调,有统计学意义(P<0.05)。
　　 6.与对照组相比,实验组肿瘤组织中凋亡细胞明显增多,两组AI分别为:1.63±0.30.17.39±2.78,组间有显著性差异(P<0.05)。
　　 结论:
　　 本研究前两部分采用MTT方法、流式细胞术及电镜技术检测熊果酸对人舌癌Trca8113细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响,采用免疫细胞化学技术、RT—PCR技术以及Western Blot免疫印迹等分子生物学技术检测了熊果酸对人舌癌Tca8113细胞基因NF—κB、VEGF、Bcl-2、Bax mRNA及蛋白表达的影响。第三部分采用上述部分方法进行熊果酸作用后的Tca8113裸鼠移植瘤的检测,得出如下结论:
　　 1.熊果酸对人舌癌Tca8113细胞具有增殖抑制作用,并且呈时间剂量依赖性。
　　 2.熊果酸对人舌癌Tca8113细胞具有诱导凋亡作用,并且存在时间依赖性。
　　 3.熊果酸能下调人舌癌Tca8113细胞的NF—κB、VEGF、Bcl-2 mRNA以及蛋白表达,能上调Bax表达,改变了Bcl-2／Bax的比例,且具有时间依赖性。此作用可能是其抑制细胞增殖的机制之一。
　　 4.熊果酸参与Tca8113细胞周期调控,使细胞阻滞于G0／G1期。熊果酸对细胞的增殖抑制、诱导凋亡及相关基因的抑制作用可能均与其G0／G1期阻滞有关。
　　 5.成功构建了人舌癌Tca8113细胞裸鼠移植瘤模型,证实熊果酸能抑制舌癌移植瘤生长,且对机体无明显毒、副作用。
　　 6.与体外实验结果相似,熊果酸能下调舌癌裸鼠移植瘤NF—κB、VEGF、Bcl-2mRNA以及蛋白表达,上调Bax mRNA及蛋白表达。诱导细胞凋亡,抑制移植瘤生长。
　　 本研究为熊果酸的临床应用提供一定的参考资料。