血浆中微小RNA-144*扩增在大肠癌非侵入性诊断中的应用

摘要

目的：小分子RNA(microRNAs,miRNA)是近年来新发现的一类具有短小、内源性、非编码特性的单链RNA分子,其编码基因是目前最大的一类调节基因,可以通过抑制或降解转录后的信使RNA来调节某些基因的表达。miRNA通过对其靶基因的调控在组织发育、细胞增殖和细胞凋亡等基本生理学过程中发挥着重要作用,而细胞的过度增殖以及异常死亡都是癌症的显著特征,由此提示出肿瘤的发生、发展与miRNA之间可能存在着关联,生物体内众多的miRNA参与调节着肿瘤细胞的多种重要生物学行为。目前发现很多miRNAs在恶性肿瘤中异常表达。大肠癌(Colorectal cancer,CRC)是消化系统常见的恶性肿瘤之一,其发病率在美国占所有恶性肿瘤的发病率的第三位,在癌症所致的死亡中位居第二,在我国,大肠癌发病率和死亡率仅低于胃癌、食管癌、肺癌等,其发病率和死亡率仍呈现出逐年上升的趋势。众多的研究都指出大肠癌的发生是多因素、多步骤的复杂过程。由于大部分的大肠癌均以大肠内腺瘤样息肉为前期病变,因此,对于结肠肿瘤的筛查十分必要。传统的检查方法都有其明显的弊端,基于血浆中微小RNA水平的检测作为一种新的无创性检查应用而生。肿瘤源性miRNA能极其稳定的形式存在于人体组织、血浆及粪便环境中,并且不受内源性核糖核酸酶活动的影响。特异miRNA的过度表达和沉默都与大肠癌的发生及进展有关,在组织、血液和粪便中特异miRNA的表达量不同,提示了其在大肠癌早期发现和筛检中的应用前景。本研究中选用miR-144*作为实验研究对象,初步探讨其在大肠癌的非侵入性诊断中的作用。
　　 方法：55例CRC、30例大肠腺瘤、30例IBD患者均为郑州大学第一附属医院2010年3月至2011年12月间行结肠镜检查,经组织病理检查明确诊断。55例CRC组中,男34例,女21例,年龄33-82岁;大肠腺瘤组,男22例,女8例,年龄29-72岁;30例IBD患者中男性21例,女性9例,年龄范围21-69岁。另选30例年龄匹配的全结肠镜检查阴性的健康人为健康对照组。4组年龄和性别差异均无统计学意义。收集上述患者未治疗前血浆标本;收集43例CRC患者行手术治疗后7天的血浆标本,其中:行大肠癌根治术患者30例,行大肠癌姑息性手术患者13例;收集大肠腺瘤患者行腺瘤切除后7天的血浆标本。用SDS进行血浆样本的预处理,利用Trizol试剂对经过预处理后的血浆样本进行总RNA的提取,使用紫外分光光度计测定抽提的总RNA在A260的吸光度值,计算其浓度,得到纯化后的血浆RNA样本;按照逆转录试剂盒的说明书的操作步骤合成cDNA;使用荧光定量RT-PCR技术检测miR-144*在CRC、大肠腺瘤、IBD及健康对照组血浆中的表达量。miRNA的表达量的计算方法采用2-△△ct相对定量法,将不同血浆标本的RQ值(RQ=2-△△Ct)进行比较。数据采用SPSS17.0统计软件进行处理,miR-144*相对表达水平与临床病理资料的联系采用非参数检验,其中两组之间比较采用Mann-WhitneyU检验,三组之间的比较采用Kruskall-Wallis检验。P＜0.05认为有统计学差异。检验水准α=0.05。
　　 结果：⑴在人大肠癌组血浆标本中,miR-144*较非大肠癌组中相对表达量增高,miR-144*的表达量与大肠癌块的大小(p＜0.001)及肿瘤浸润深度(p=0.026)有关,肿瘤越大,浸润深度越深,miR-144*表达量越高。⑵在43例行大肠癌手术治疗的大肠癌患者术后7天的血浆标本中,30例行大肠癌根治术患者的血浆标本中有27例miR-144*的相对表达量较术前降低(P=0.021);13例行大肠癌姑息性手术患者的血浆标本中miR-144*的相对表达量较术前无明显差异(p=0.230)。⑶大肠腺瘤组中,进展期腺瘤和非进展期腺瘤在行腺瘤切除术前后的血浆标本中miR-144*的表达量无明显变化。
　　 结论：①miR-144*在大肠癌患者的血浆中的表达显著增高,其表达量高低与肿瘤大小及肿瘤浸润深度有关。②大肠癌手术后血浆中miR-144*的表达量下降。③血浆中miRNA-144*的检测可作为非侵入性手段筛查大肠癌。