胎盘羊膜包裹脱细胞同种异体神经复合BDNF和CNTF转染BMSCs纤维蛋白胶桥接的实验研究

摘要

周围神经损伤后的再生与修复一直是神经科学领域的重要课题。在神经再生中BDNF和CNTF非常重要，局部微环境中的神经生长因子的浓度差对近端生长锥的诱导作用是重要机制之一，在基因分子生物学和组织工程方面促进神经的再生将是非常有前景的研究方向。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，近年发现其可以经诱导分化为神经细胞，具有潜在的修复神经损伤的能力。本实验我们使用医用胶涂抹固定的方法，把胎盘羊膜包裹脱细胞同种异体神经复合BDNF和CNTF转染BMSCs纤维蛋白胶的移植技术应用于修复大鼠坐骨神经缺损的实验，并对其机制做了初步探讨，以期为明确其修复周围神经损伤的机制和进一步临床应用提供实验依据。本实验共分为四部分:
　　 第一部分:大鼠BMSCs的分离培养和鉴定
　　 第二部分:BDNF和CNTF表达载体构建及在骨髓间充质干细胞中表达
　　 第三部分:脱细胞同种异体神经和胎盘羊膜的制备
　　 第四部分:胎盘羊膜包裹脱细胞同种异体神经复合BDNF和CNTF转染BMSCs纤维蛋白胶桥接的实验研究
　　 第一部分：大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定
　　 目的：研究间充质干细胞的分离培养并鉴定。
　　 方法：采用贴壁法在体外分离培养大鼠BMSCs，相差显微镜观察原代和传代细胞形态，流式细胞仪检测。
　　 结果：实验结果显示分离培养的BMSCs为贴壁生长的成纤维样细胞，传代后的细胞均一性好。
　　 结论：间充质干细胞有很强的增殖能力，而且容易获取和培养。
　　 第二部分：BDNF基因修饰骨髓间充质干细胞的建立及体外表达
　　 目的：骨髓间充质干细胞(BMsCs)易于分离扩增，具备多方向分化潜能，免疫源性低，可自体移植，并且有良好迁移性，预示其在基因治疗中可能成为有价值的运载细胞。本实验利用载体介导脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)和睫状神经营养因子(Ciliary Neurotrophic Faetor，CNTF)转染MSCS，观察细胞转染特性和体外表达情况，建立基因工程细胞，为进一步体内研究提供基因工程细胞来源。
　　 方法：取大鼠的骨髓进行MSCS的分离、培养和流式细胞仪鉴定。选择较好的方法介导PcDNA3.1（-）-BDNF和CNTF转染MSCs并经优化浓度的G418筛选建立基因工程细胞，用免疫组化检测BDN下基因表达情况，RT-PCR进一步验证目的基因表达情况。
　　 结果：成功培养BMSCs，流式细胞鉴定显示各细胞表面标志表达率分别为CD44:93.25％、CD34:4.63％、CD45:8.01％。转染成功扩大培养并建立工程细胞(BDNF和CNTF-MSCS)，免疫组化显示BDNF和CNTF阳性表达率达90％，RT-PCR扩增产物电泳证实目的基因阳性条带。
　　 结论：成功建立BDNF和CNTF基因修饰MSCS的工程细胞，并用免疫组化和RT-PCR方法证实了工程细胞具备体外表达目的基因功能。
　　 第三部分：脱细胞异体神经和胎盘羊膜的制备
　　 目的:制备脱细胞异体神经和胎盘羊膜.
　　 方法:将用Sondell法(TritonX-100、脱氧胆酸钠)和改良法[TritonX-200，sulfobetaine-10(SB-10)，sulfobetaine-16(SB-16)]两种方法制备的去细胞异体神经及参考陈有刚、朱家恺方法制备胎盘羊膜，用HE染色、髓鞘染色、免疫组化染色等进行组织学评价。
　　 结果:改良法制备的神经及胎盘羊膜髓鞘及细胞去除彻底、结构保存完整。
　　 结论:综合运用萃取剂TritonX-200，SB-10和SB-16的改良化学萃取方法是一种较为理想的去细胞异体神经制备方法，其制备的异体神经移植物可望替代自体神经移植。胎盘羊膜达到要求。
　　 第四部分：胎盘羊膜包裹脱细胞同种异体神经复合BDNF和CNTF转染BMSCs纤维蛋白胶桥接的实验研究
　　 目的:将胎盘羊膜包裹脱细胞同种异体神经复合BDNF和CNTF转染BMSCs纤维蛋白胶的移植技术应用于修复大鼠坐骨神经缺损的实验，并对其机制做了初步探讨，以期为明确其修复周围神经损伤的机制和进一步临床应用提供实验依据。
　　 方法:取35只SD大鼠，10％水合氯醛注射(0.4mL/100g)麻醉，麻醉持续时间2～2.5小时。无菌条件下暴露右侧坐骨神经，切除7mm坐骨神经，一般在梨状肌下缘3mm处切除，任坐骨神经自然回缩，这样就做成了10mm坐骨神经缺损模型。将大鼠随机分组为A组、B组、C组、D组、E组、F组、G组(n=5):
　　 A组，CEANA移植组，采用10mmCEANA端端吻合缺损的坐骨神经，坐骨神经缺损后，移植段周围微量注射器注射0.1mL生物蛋白胶;
　　 B组，BDNF+CNTF/BMSCs生物蛋白胶复合CEANA组，采用CEANA端端吻合缺损的坐骨神经，在移植神经段周围注入浓度为33mg/L的BDNF+CNTF/BMSCs生物蛋白胶复合物0.1mL;
　　 C组，胎盘羊膜包裹BDNF+CNTF/BMSCs生物蛋白胶复合CEANA组，神经两断端间就能分化为间距约4mm的神经再生室。手术时随机向再生室内注入浓度为33mg/L的BDNF+CNTF/BMSCs生物蛋白胶0.1mL。为了避免营养因子渗出，注射以后，将处理过的人胎盘羊膜基质膜包裹套和CEANA段衔接。
　　 D组，胎盘羊膜包裹BDNF/BMSCs生物蛋白胶复合CEANA组，采用CEANA端端吻合缺损的坐骨神经，在移植神经段周围注射生BDNF/BMSCs生物蛋白胶复合物0.1mL;
　　 E组，胎盘羊膜包裹CNTF/BMSCs生物蛋白胶复合CEANA组，采用CEANA端端吻合缺损的坐骨神经，在移植神经段周围注射生CNTF/BMSCs生物蛋白胶复合物0.1mL;
　　 F组，胎盘羊膜包裹BMSCs生物蛋白胶复合CEANA组，采用10mmCEANA端端吻合坐骨神经缺损后，移植段周围微量注射器注射0.1mLBMSCs生物蛋白胶复合物;
　　 G组，胎盘羊膜包裹生物蛋白胶复合CEANA组，采用10mmCEANA端端吻合坐骨神经缺损后，移植段周围微量注射器注射0.1mL生物蛋白胶;
　　 各组小鼠分笼饲养。实验动物坐骨神经未损伤侧（左侧）切开暴露坐骨神经，作为正常对照组。
　　 术后行大体观察;术前及术后2、4、6、8周测量小鼠坐骨神经指数(static sciatic index，SSI);术后8周取材计算术侧小腿三头肌湿重恢复率并行小腿三头肌Masson染色观察，吻合口远端神经行甲苯胺蓝染色。
　　 结果：术后各组动物切口愈合良好。各组SSI随时间延长逐渐增加，术后4、6、8周C组SSI均高于A、G组，差异有统计学意义(P＜0.05);C组略高于D、E、F组，但差异无统计学意义(P＞0.05)。术后8周，D、E、F组小腿三头肌湿重恢复率、有髓神经纤维总数均优于A、G组，但较C组差，差异有统计学意义(P＜0.05);C组小腿三头肌纤维面积、髓鞘厚度均优于A、G组(P＜0.O1)，而与D、E、F组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　 结论：胎盘羊膜包裹脱细胞同种异体神经复合BDNF和CNTF转染BMSCs纤维蛋白胶的移植技术应用于修复大鼠坐骨神经缺损可提高周围神经损伤修复效果。

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

第一部分 大鼠BMSCs的分离培养和鉴定

1、材料与方法

1．1 实验试剂

2．实验动物

3．实验方法

3．1．大鼠BMSCs的制备

3．2 大鼠BMSCs一般生物学特性的观察

3．4 细胞形态学观察

3．5 流式细胞仪测定

3．6 观察BMSCs生物蛋白胶复合物的生物活性

4．讨论

小结

参考文献

第二部分 BDNF和CNTF表达载体构建及在骨髓间充质干细胞中的表达

1．1 真核表达载体PIRES

1．2 菌株

1．3 引物

1．3．1 BDNF cDNA码区全长扩增引物

1．3．2 CNTF cDNA码区全长扩增引物

1．3．3 BDNF基因表达检测引物

1．3．4 CNTF基因表达检测引物

1．3．5 内参标GAPDH引物

1．4 cDNA克隆

1．5 主要试剂

1．6 主要试剂的配制

1．7 主要仪器设备

2 实验方法

2．1 重组表达载体pIRES-BDNF的构建

2．2 重组表达载体pIRES-CNTF的构建

2．3 重组双基因表达载体pIRES-BDNF-CNTF的构建

3．实验结果

3．1 目的基因BDNF、CNTF扩增结果

3．2 重载体pIRES-BDNF、pIRES-CNTF的鉴定结果

3．4 重组双基因表达载体pIRES-BDNF-CNTF的构建结果

3．5 细胞转染

3．6 RT-PCR检测BDNF mRNA、CNTF mRNA表达情况

3．7 免疫印迹检测BDNF和CNTF蛋白表达

3．8 统计学分析

4 结果

4．1 细胞转染结果

4．2 RT-PCR检测结果

4．3 免疫印迹检测结果

5．讨论

小结

参考文献

第三部分 脱细胞同种异体神经和胎盘羊膜的制备

1 材料与方法

1．1 实验动物

1．2 主要药品和试剂

1．3 主要仪器

2．制备脱细胞异体神经

2．1 对化学脱细胞同种异体神经进行检测

3．胎盘羊膜的制备

3．1．羊膜来源

3．2．胎盘羊膜的制备

小结

参考文献

第四部分 胎盘羊膜包裹脱细胞同种异体神经复合BDNFCNTF转染BMSCs纤维蛋白胶桥接的修复周围神经缺损的实验研究

1．材料与方法

1．1 实验动物

1．2 主要实验设备

1．3 主要试剂

1．4 主要试剂配制

1．5 BDNF和CNTF表达载体构建及在骨髓间充质干细胞中表达

1．6 脱细胞同种异体神经(chemical extracted acellular nerveallograft，CEANA)和胎盘羊膜的制备

1．7 周围神经缺损动物模型制备及分组

1．8 手术方法

2．观察指标与方法

2．1 大体观察

2．2 坐骨神经功能指数(sciatic functional index，SFI)

2．3 小腿三头肌湿重恢复率测定

2．4 肌电图检测

2．5 组织形态学观察

2．6 免疫印迹检测

3 统计方法

4 结果

4．1 一般情况

4．2 两组的移植段神经大体观察

4．3 SSI测定

4．4 小腿三头肌湿重恢复率测定

4．5 轴突计数

4．6 神经电生理检测

4．7 神经移植体HE染色

4．8 免疫印迹检测结果

5．讨论

5．1 BDNF和CNTF与周围神经的修复

5．2 BMSCs和神经的修复

5．3 脱细胞的再生室和同种异体神经与周围神经缺损的修复

5．4 同种异体神经复合BDNF和CNTF转染BMSCs生物蛋白胶桥接的修复周围神经缺损的结果分析

小结

参考文献

全文结论

文献综述：应用组织工程和基因工程技术对周围神经损伤的修复

致谢

攻读博士期间发表的论文、著作及获得的奖励