阻断PI3K/AKT/mTOR信号传导通路对胃癌细胞放化疗耐受影响的实验研究

摘要

背景与目的：
　　胃癌是临床常见的消化道恶性肿瘤。超过70％的新发病例和死亡病例出现在发展中国家。胃癌治疗的主要手段有手术、放疗和化疗。但是部分患者经过放疗、化疗后仍然会出现局部进展和放化疗耐受的情况。因此，明确胃癌治疗后局部进展和放化疗耐受的机制，从而增强胃癌细胞对放疗和化疗的敏感性，提高放化疗的有效率是胃癌治疗过程中亟待解决的问题。
　　本研究以胃癌细胞株BGC-823为研究对象，从以下两个方面进一步探讨胃癌放化疗治疗后肿瘤局部进展以及放化疗耐受的可能机制:1.胃癌细胞经过化疗药物处理后的细胞干性、EMT、PI3K通路蛋白、耐药相关酶以及对放疗敏感性变化的研究；2.通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路提高放化疗敏感性的机制研究。
　　第一部分胃癌细胞经过化疗药物处理后的细胞干性、EMT、PI3K通路、化疗敏感性的变化及放疗耐受的可能机制
　　目的：
　　比较5-FU，L-OHP单独或者联合处理胃癌细胞后，肿瘤细胞干细胞标志物、EMT标志物、细胞周期、药物代谢酶以及信号传导通路的变化。分析细胞出现化疗药物和放射线耐受的原因和可能机制。
　　方法：
　　采用CCK-8法检测氟尿嘧啶（Fluorouracil，5-FU）,奥沙利铂（Oxaliplati， L-OHP）作用胃癌细胞的抑制率，计算IC50,比较细胞形态学差异；采用Western blotting和RT-PCR检测化疗药物处理细胞后CD44、Nanog、Oct4、Sox2、E-cadherin和 N-cadherin表达情况。Western blotting方法检测化疗药物对胃癌细胞PI3K/AKT/mTOR信号传导通路蛋白、胸苷酸合成酶（Thymidylate synthase，TS酶）、二氢嘧啶脱氢酶（Dihydropyrimidine dehydrogenase，DPD酶）和ERCC1蛋白表达的影响。流式细胞技术检测化疗药物对胃癌细胞细胞周期的影响；克隆形成实验比较药物处理后细胞接受不同剂量放射线照射后克隆形成能力的差异。免疫组化方法分析胃癌术后患者组织标本中Nanog、Oct4、Sox2和E-cadherin蛋白表达情况。以及 Nanog、Oct4、Sox2和 E-cadherin表达水平同患者预后之间关系。
　　结果：
　　未经处理的胃癌细胞呈相互连接生长，使用化疗药物处理细胞后，细胞间连接减少，细胞变圆，失去正常形态。Western blotting和RT-PCR均提示化疗药物治疗肿瘤细胞后引起干细胞标志物的表达升高，特别是5-FU+L-OHP治疗组升高更明显。5-FU+L-OHP组的CD44、Nanog、Oct4和Sox2表达明显高于单用5-FU或者L-OHP处理组。而5-FU+L-OHP组的E-cadherin表达和其他治疗组以及未治疗细胞相比表达明显下调，相反 N-cadherin表达却明显上调。同时，化疗药物处理细胞后引起TS酶、DPD酶和ERCC1等蛋白升高，降低胃癌细胞对化疗药物的敏感性。对信号传导通路蛋白分析提示，药物处理后的细胞出现PI3K/AKT/mTOR信号传导通路蛋白p-AKT和p-mTOR、p85和p110表达的升高。特别是5-FU+L-OHP治疗组通路蛋白升高更为明显。对肿瘤细胞的细胞周期分析结果显示，细胞经化疗药物处理后使S期细胞亚群比例由30±0.8%升高到80±1.7%。克隆形成实验表明联合处理组细胞对放射线具有耐受性。对人胃癌组织术后标本的分析发现, Nanog、 Oct4、 Sox2和 E-cadherin在标本中的表达率分别为26.1%、53.6%、49.3%和60.9%。Nanog、Sox2、Oct4和E-cadherin的表达同患者的性别、年龄和分化程度无关，但是Sox2表达差异同临床分期有关。Oct4的表达水平同淋巴结侵犯有关。E-cadherin表达水平同淋巴结侵犯及临床分期相关。Oct4的高表达和E-cadherin低表达同患者术后复发相关。
　　结论：
　　化疗药物处理细胞后出现干细胞标志物表达上调，E-cadhrein表达下调，同时药物代谢酶升高，细胞周期阻滞在S期，PI3K/AKT/mTOR信号传导通路激活，细胞对放化疗出现耐受性。
　　第二部分PI3K/AKT/mTOR信号传导通路在胃癌放化疗耐受中的作用
　　目的：
　　第一部分结果提示化疗药物处理细胞后引起细胞干性增强、EMT增强、耐药相关酶表达升高、PI3K/AKT/mTOR信号通路激活、细胞周期S期阻滞和细胞对放化疗耐受。采用 NVP-BEZ235阻滞该信号传导通路，分析其对肿瘤细胞干细胞性，细胞周期，放化疗耐受的影响。
　　方法：
　　采用 CCK-8方法检测 NVP-BEZ235对联合药物处理后细胞增殖的影响。Western blotting分析 NVP-BEZ235处理细胞后干细胞标志物以及 EMT标志物CD44、Nanog、Oct4、Sox2、E-cadherin和 N-cadherin表达情况。比较阻断PI3K/AKT/mTOR通路后对该信号传导通路蛋白p85、p110、p-AKT和p-mTOR，以及TS酶、DPD酶和ERCC1等的影响。流式细胞技术分析NVP-BEZ235对细胞周期的影响。克隆形成实验比较阻断信号传导通路后细胞对放疗敏感性是否恢复。
　　结果：
　　NVP-BEZ235对联合化疗药物处理后细胞具有杀伤作用。采用其阻断PI3K/AKT/mTOR信号传导通路后，引起干细胞标志物CD44、Nanog、Oct4和Sox2表达下调。EMT标志物E-cadherin表达上调，N-cadherin表达下调。同时通路蛋白p85、p110、p-AKT和p-mTOR以及TS酶，DPD酶和ERCC1表达均下调。说明该通路阻滞后肿瘤细胞的干细胞性减弱，EMT现象下降，药物耐药酶的表达降低，细胞对化疗敏感性部分恢复。细胞周期分析，使用NVP-BEZ235后 S期细胞亚群比例由80±1.7%下降到36.3±3.2%。克隆形式试验也说明阻断PI3K/AKT/mTOR通路后，细胞对放疗的敏感性部分恢复。
　　结论：
　　通过阻断细胞PI3K/AKT/mTOR信号传导通路，能够降低胃癌细胞的干细胞性，降低EMT的发生，降低化疗耐药酶的表达，同时提高肿瘤细胞对放疗的敏感性，提高胃癌放化疗的疗效。

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符号说明

第一部分 胃癌细胞经过化疗药物治疗后的细胞干性， EMT及PI3K通路的变化

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

第二部分 PI3K/AKT/mTOR信号传导通路在胃癌化放疗耐受中的作用

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

全文结论

综述: PI3K/AKT/mTOR信号传导通路的研究现状

个人简历

在学期间发表的学术论文与研究成果

致谢