NOTCH3(R90C)突变对少突胶质系细胞HS683活力的影响及机制研究

摘要

背景：
　　伴皮层下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病(cerebralarto-somaldominantarteriopathwithsubcorticalinfarctsandleukoence-phalopathy，CADASIL）是最常见的一种神经遗传性脑血管病。核磁共振成像（MRI）表现为脑内弥漫性脱髓鞘性改变，目前发生在颞极的白质脱髓鞘已经被认为是CADASIL的特征性影像学表现。CADASIL的致病基因被定位于19p13.1-13.2的NOTCH3上，以往研究认为NOTCH3在成体仅表达在VSMCs中，而CADASIL患者的脱髓鞘病理改变是致病突变NOTCH3蛋白引起VSMCs的退行性改变后发生缺血缺氧的次级事件，但是，近来越来越多的研究表明NOTCH3在成体的表达不仅仅局限于VSMCs中，在成体斑马鱼的少突胶质细胞中也检测到有NOTCH3基因的表达。因此，我们推测CADASIL患者的脱髓鞘不仅仅是发生在缺血缺氧后的次级事件，突变的NOTCH3对少突胶质系细胞的直接影响可能也参与了该发病过程。然而目前突变的NOTCH3对少突胶质系细胞的直接作用尚未见有关报道。
　　NOTCH3是一个单次跨膜受体蛋白，与配体结合后会发生一系列蛋白水解反应，水解过程中会首先释放出NTMIC（部分跨膜域+胞内域）然后水解出NICD（胞内域）到细胞核，与CLS转录因子结合，启动靶基因(HES，HERT等)的表达。在VSMCs中的研究表明过表达NOTCH3蛋白能够通过cross-talk与苏氨酸激酶/丝裂原活化蛋白激酶(ERK/MAPK)信号相互作用并上调c-FLIP，抑制细胞凋亡。但是突变的NOTCH3在少突胶质系细胞中对c-FLIP的影响及对细胞活力的影响和机制在国内外尚未见相关报道。
　　本研究通过过表达野生型NOTCH3与致病突变型NOTCH3(R90C)于少突胶质来源的细胞系HS683中，观察突变的NOTCH3(R90C)对HS683活力的影响，并初步探讨了NOTCH3(R90C)引起HS683活力改变的相关的分子机制。
　　目的：
　　观察突变型NOTCH3(R90C)对少突胶质系细胞HS683活力的影响，并初步探讨NOTCH3(R90C)引起HS683细胞活力改变的相关的分子机制。
　　方法：
　　1.运用分子克隆技术构建空白对照载体pCMV-Sport6.0，定点突变法构建突变型NOTCH3（R90C）表达载体pCMV-Sport6.0-NOTCH3(R90C)。
　　2.真核细胞转染技术转染空白对照载体pCMV-Sport6.0，野生型NOTCH3基因表达载体pCMV-Sport6.0-NOTCH3、突变型pCMV-Sport6.0-NOTCH3(R90C)基因表达载体到少突胶质系细胞HS683中（分别命名为control组，WTN3组，R90C组，）。
　　3.CCK8法检测细胞的活力，流式细胞术检测细胞的凋亡水平和活性氧（ROS）水平。
　　4.Pifithrin-α抑制p53蛋白的活力。
　　5.Western-blot技术检测细胞中内源性线粒体凋亡蛋白p53，p-p53，p21，外源性凋亡相关蛋白caspase8，caspase3，c-FLIP的表达水平以及自噬相关蛋白LC3B-II的表达水平。
　　结果：
　　1．免疫荧光及Western-blot结果显示，HS683细胞本身有基础水平的NOTCH3蛋白的表达，与control组相比WTN3组和R90C组成功过表达NOTCH3蛋白，R90C组的NTMIC/NOTCH3-FL比值显著高于WTN3组和control组（P<0.05）。
　　2．CCK-8结果显示：在转染后的48h、72h与control组和NOTCH3组相比R90C组细胞的活力明显降低（P<0.05），加入pifithrin-α抑制p53蛋白的活性后，HS683细胞的活力能够被部分逆转。
　　3.流式细胞术检测结果显示：在转染细胞后48h，72h，R90C组的细胞凋亡率显著高于WTN3组和control组（P<0.05）。但内源性的ROS水平未见三组间有明显差异。
　　4．Western-blot结果显示：转染后72h，内源性细胞凋亡相关蛋白p53，p-p53，p21蛋白的表达水平在R90C组均高于WTN3组和control组（P<0.05），同时，外源性细胞凋亡相关蛋白caspase3，caspase8的表达水平在R90C组均高于WTN3组和control组，c-FLIP的表达量在R90C组明显低于WTN3与control组（P<0.05）。R90C组细胞的LC3B-II/β-actin水平显著高于control组和WTN3组（P<0.05）。
　　结论：
　　1．突变型NOTCH3(R90C)可能能够通过内源性和外源性细胞凋亡途径以及细胞自噬降低HS683细胞的活力。
　　2．突变型NOTCH3(R90C)可能能够直接损害少突胶质细胞引起细胞的脱髓鞘病变。

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中英文缩略词

前言

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 成功构建空白载体和突变的NOTCH3载体NOTCH3(R90C)

2.2 观察HS683的转染效率，NOTCH3在HS683中表达的检测

2.3 细胞的活性检测

2.4 NOTCH3(R90C)转染细胞能显著增加细胞的凋亡水平

2.5 内源性线粒体凋亡途径和由c-FLIP、Caspase8介导的外源性细胞凋亡途径参与了R90C组细胞活力的降低

2.6 自噬标志蛋白LC3B在细胞中表达的检测

2.7 氧化应激水平的检测

3 讨论

4 结论

参考文献

综述: NOTCH3突变导致CADASIL的发病机制研究进展

个人简历、在校期间发表论文与研究成果

致谢