基于生物信息学的胃癌易感性相关lncRNAs及其功能性SNPs的筛选和功能验证

摘要

胃癌（Gastric Cancer,GC）发病率和死亡率均居全国癌症发病和死亡的第二位，其早期诊断率和中晚期胃癌5年生存率均低于20％，近年胃癌发病呈现上升和年轻化趋势。长链非编码 RNAs（Long Noncoding RNA,LncRNAs）是指各种长度大于200个核苷酸且不翻译成蛋白质的RNA分子，在转录、转录后以及表观遗传等水平调控基因表达，广泛参与机体的生理和病理过程。越来越多研究发现lncRNAs与胃癌的发生、转移、预后和耐药性形成等有关，有望成为胃癌早期诊断和预后生物标志物，但lncRNAs发挥作用的机制尚未阐明。
　　目的：
　　基于生物信息学，筛选胃癌相关lncRNAs及其功能性单核苷酸多态位点（Single Nucleotide Polymorphism,SNP），在大样本人群中验证lncRNA遗传变异与胃癌易感性的关联，并初步探讨其生物学功能。
　　方法：
　　1.生物信息学筛选：
　　检索并下载GEO数据库中基于中国人群的胃癌相关芯片数据（GSE50710,GSE53137,GSE58828）。本研究整合多种数据库（Ensembl,refseq, lncRNAdb.v2.0,GENCODE.v24,NONCODE2016,LNcipedia.v3.1,CCDS.v18）并去冗余，采用本地BLASTN算法对高通量芯片进行重注释。
　　然后通过生物信息学方法筛选出差异表达的胃癌相关 lncRNAs并预测其功能，与microRNAs具有潜在结合位点的lncRNAs及其SNPs进入下一步的人群验证。
　　2.大样本人群验证：
　　采用病例对照研究设计，用PASS8.0.14（http://www.ncss.com/pass.html）计算所需样本量，按年龄（±3岁）和性别以1：1进行个体匹配，收集470例医院来源且经病理学确诊的胃癌患者及社区来源的470例正常对照的血液样本。
　　采用聚合酶链式反应-限制性片段长度分析法（PCR-RFLP）对lncRNAs基因及其SNP进行基因分型。采用SAS9.1（SAS Institute Inc.,Cary,North Carolina,USA）软件进行统计分析。Hardy-Weinberg在线分析工具对对照人群进行 Hardy-Weinberg平衡检验。MDR2.0软件分析基因-环境交互作用。
　　3.生物学功能初探：
　　采用荧光定量逆转录-聚合酶链式反应（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测41例样本血清中不同基因型lncRNA表达量。
　　通过荧光素酶报告基因实验检验SNP等位基因变异是否影响相应lncRNA与预测的miRNA的结合。
　　结果：
　　1.本研究整合构建的蛋白编码数据库含120,018条记录，长链非编码RNAs数据库含206,510条记录。共筛选出189个胃癌相关差异表达lncRNAs，最终选择4个具有潜在的miRNA结合功能的lncRNAs及其SNP进行后续的人群验证，分别是lnc-EVX1-3:3（rs1859168）、lnc-MACC1-1:7（rs3815254）、lnc-AMFR-1:1（rs4784659）、lnc-ZNF33B-2:1（rs579501）。
　　2.年龄、性别和饮酒在病例和对照组中的分布无统计学差异（P>0.05），而吸烟和肿瘤家族史在病例组中的比例显著高于对照组（P<0.05）。多因素非条件logistic回归分析结果显示，调整年龄、性别、吸烟、饮酒及肿瘤家族史后，在显性（OR=0.64,95%CI:0.47-0.86）和隐性遗传模型（OR=1.77,95%CI:1.34-2.35）中均观察到rs1859168 A等位基因的变异与胃癌的发病风险降低存在统计学关联；在显性（OR=0.42,95%CI:0.31-0.57）和加性模型（OR=0.52,95%CI:0.40-0.67）中均发现rs4784659T能够降低胃癌的发病风险；同样，显性（OR=0.72,95%CI:0.52-0.98）和加性模型（OR=0.73,95%CI:0.56-0.97）也提示携带rs579501C等位基因的个体胃癌易感性较低；但在四种模型中均未发现rs3815254（C>T）与胃癌发病风险之间存在统计学关联（all P>0.05）。
　　3.基于显性模型，分别对年龄（﹤50 vs.≥50）、性别（男vs.女）、吸烟（是vs.否）、饮酒（是vs.否）及肿瘤家族史（是vs.否）进行分层分析，并调整其余因素后，发现rs1859168A, rs579501G等位基因的变异仅在部分层中显示能够显著降低胃癌的发病风险，而rs4784659T等位基因的变异在所有分层亚组中一致显示与胃癌的发病风险降低有统计学关联，且这种保护作用在不吸烟人群（OR=0.23,95%CI:0.14,0.38）中相比吸烟人群（OR=0.65,95%CI:0.43,0.98）更明显（P<0.001）。
　　4.最佳基因-环境交互作用模型表明具有吸烟史，肿瘤家族史，携带rs4784659 CC，rs1859168 CC/AC和rs579501AA人群患胃癌的风险是非上述组合人群的5.03倍（OR:5.03;95%CI:3.81-6.65）。
　　5.双荧光素酶报告基因实验表明共转染miR-5002-5p后，携带rs579501 A等位基因报告质粒的相对荧光素酶活性降低，而共转染miR-5002-5p的抑制剂后，其相对荧光素酶活性升高。
　　6.生物信息学预测结果显示，rs4784659 G等位基因向A等位基因的变异，为hsa-miR-6852-3p与lnc-AMFR-1:1提供了结合位点，可能导致lnc-AMFR-1:1表达水平降低及hsa-miR-6852-3p的靶基因表达水平升高。
　　7.qRT-PCR结果显示，rs4784659 AG（0.52±0.33,n=14）和rs4784659 AA（0.21±0.14,n=9）基因型个体血浆中lnc-AMFR-1:1的表达量（X?S）均低于rs4784659 GG（0.87±0.34,n=18）基因型个体（both P<0.017）。
　　结论
　　1.rs4784659 T、rs579501 C和rs1859168 A等位基因变异均与胃癌易感性降低有潜在关联。
　　2.rs579501 A等位基因可能通过促进hsa-miR-5002-5p与lnc-ZNF33B-2:1的结合，进而抑制lnc-ZNF33B-2:1的表达，而rs4784659 G等位基因向A等位基因的变异是否影响hsa-miR-6852-3p与lnc-AMFR-1:1的结合，尚需进一步的生物学功能实验验证。
　　3.本研究为胃癌的早期诊断和治疗提供了潜在的生物标志物，为深入研究lncRNAs在胃癌发病中的作用和机制提供了重要线索。

目录

声明

英文缩略词表

1 前言

2 材料方法

2.1 技术路线

2.2 生物信息学筛选胃癌相关lncRNA

2.3 生物学实验

2.4 研究方法

2.5 生物学功能初探

2.6 质量控制

2.7 统计学分析

3 结果

3.1 研究对象的一般情况

3.2 基因分型结果

3.3 对照组各位点基因型Hardy-Weinberg平衡的检验

3.4 候选lncRNA及其功能性SNPs和胃癌易感性的关系

3.5 基于显性遗传模型的SNPs与胃癌易感性分层分析

3.6 假阳性结果报告率分析

3.7 基因-环境因素交互作用

3.8 血浆中总RNA的提取

3.9 不同rs4784659 基因型人群血浆中lnc-AMFR-1:1的表达量

3.10 荧光素酶报告基因实验结果

4 讨论

4.1 本研究概述

4.2 胃癌易感性相关lncRNAs及其SNPs与生物学功能探究

4.3 本研究的优点和局限性

5 结论

参考文献

附录

综述:肿瘤相关长链非编码 RNAs——功能、机制和生物标志物

个人简历及学术论文发表情况

致谢