甲磺酸阿帕替尼治疗恶性黑色素瘤的实验研究及临床观察

摘要

目的:
　　黑色索瘤(melanoma)是一种常见的恶性肿瘤，可发生于皮肤、消化道、呼吸道以及生殖系统的粘膜，也可发生于体内多种器官。黑色素瘤早期常通过区域淋巴结转移，晚期经血流扩散至肺、肝、骨、脑等器官。同时，它也是一种异质性和种族性差异很大的疾病，黏膜型和非黏膜黑色素瘤作为其中两种重要的亚型，它们在流行病学、临床病理特征、基因结构和预后等方面均存在着很大的差异。黑色素瘤侵袭性强、恶性程度高，死亡率逐年上升，尤其是晚期黑色素瘤，1年生存率仅25％，中位生存期约6个月，中位无进展生存期不足2个月。在治疗上，传统的化疗及生物治疗有效率十分有限。因此，急需探索新的治疗药物和治疗模式。甲磺酸阿帕替尼作为一种新型国产的多靶点小分子血管内皮生长因子受体(VEGFR)酪氨酸酶抑制剂，主要通过高度选择性地抑制VEGFR-2酪氨酸激酶活性，从而阻断血管内皮生长因子(VEGF)结合后介导的信号传导，进而强效抑制肿瘤血管生成，最终达到抑制肿瘤细胞生长的目的。多项体内、体外试验均发现，阿帕替尼对胃癌、肝癌、乳腺癌、肺癌等多种肿瘤均具有很强的抗肿瘤活性，目前该药已经被国家食品药品监督管理总局(CFDA)批准上市，并应用于晚期胃腺癌或胃-食管结合部腺癌三线或三线以上的治疗。然而，到目前为止并未见到阿帕替尼在恶性黑色素瘤治疗中作用的详细研究。
　　前期数据显示，黑色素瘤是一种血管生成十分旺盛的肿瘤，且VEGFR在黑色素瘤中高表达，在恶性黑色素瘤的进展中发挥着重要作用。暗示阿帕替尼可能通过抑制血管生成进而在恶性黑色素瘤的治疗中发挥作用。因此，本研究在如下两个不同层面研究阿帕替尼在恶性黑色素瘤治疗中的作用:1）阿帕替尼治疗恶性黑色素瘤的实验研究;2）临床观察阿帕替尼治疗不同类型（黏膜型和非黏膜型）恶性黑色素瘤的安全性及有效性。
　　方法:
　　1阿帕替尼治疗恶性黑色素瘤的实验研究
　　1.1阿帕替尼治疗恶性黑色素瘤体外实验研究
　　1.1.1阿帕替尼对恶性黑色素瘤细胞增殖的抑制
　　1)接种B16细胞于96孔板中，每孔接种2×103个细胞，于100ul含10％胎牛血清的DMEM（高糖）培养液中。
　　2)7小时后观察，细胞已全部贴壁生长，将细胞分为四组，每组3个浓度梯度，分组如下:
　　i.对照组:各孔均加100ul新鲜培养液;
　　ii.达卡巴嗪组:加入达卡巴嗪，调整其浓度分别为100ug/ml、50ug/ml、10ug/ml，终体积均调整为200ul;
　　iii.阿帕替尼组:加入阿帕替尼，调整其浓度分别为100uM、50uM、5uM，终体积均调整为200ul;
　　iv.联合用药组:先统一加入10ug/ml达卡巴嗪，再分别加入100uM、50uM、5uM阿帕替尼，终体积均调整为200ul。
　　各组均设置3组复孔。
　　3)72小时后用细胞增殖检测试剂盒(MTS法，Promega)检测不同药物对B16细胞增值的抑制率:
　　i.待检测孔每孔加入15ul MTS溶液，37℃孵育1-4小时;
　　ii.测定490nm处各孔的吸光值(OD);
　　iii.细胞增殖抑制率计算:各测试孔OD值减去空白孔OD值，各复孔OD值取平均数。细胞增殖抑制率％=[1-(加药组细胞OD-空白OD)/(对照细胞OD-空白OD)]×100％。
　　1.1.2细胞周期检测
　　1)取对数生长期的B16细胞接种于6孔板，每孔5×104个细胞，于100ul含10％胎牛血清的DMEM（高糖）培养液中。
　　2)24小时后观察，细胞已进入对数生长期，将细胞分为四组，每组3个浓度梯度，分组如下:
　　i.对照组:只加入2ml新鲜培养液;
　　ii.达卡巴嗪组:加入达卡巴嗪，调整其浓度分别为10ug/ml，终体积调整为2ml;
　　iii.阿帕替尼组:加入阿帕替尼，调整其浓度分别50uM，终体积调整为2ml;
　　iv.联合用药组:先加入10ug/ml达卡巴嗪，再加入50uM阿帕替尼，终体积调整为2ml。
　　3)加药24小时后用细胞周期检测试剂盒检测不同药物对B16细胞周期的影响:
　　i.根据样本的数量，计算需要的工作液体积，每样本用500μl工作液孵育，使用前将RnaseA与PI工作液按照1∶9体积配制成染色工作液;
　　ii.用不含EDTA的胰酶消化收集细胞，把细胞浓度调整为1×106/ml，取1ml单细胞悬液;
　　iii.将单细胞悬液离心去除上清后，在细胞中加入70％的预冷乙醇500ul于-20℃固定2小时;
　　iv.染色前用PBS洗去乙醇，加入之前配制好的PI/RNase A染色工作液500ul，室温避光30-60min;
　　v.用流式细胞仪检测，记录激发波长为488nm处的红色荧光。
　　1.1.3细胞凋亡率检测
　　1)取对数生长期的B16细胞接种于6孔板，每孔5×104个细胞，于100ul含10％胎牛血清的DMEM（高糖）培养液中。
　　2)24小时后观察，细胞已进入对数生长期，将细胞分为四组，每组3个浓度梯度，分组设置同2.2.2。
　　3)加药24小时后用AnnexinⅤ-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒检测不同药物对B16细胞凋亡的影响:
　　i.用不含EDTA的胰酶消化收集细胞，用PBS洗涤细胞，收集5×105个细胞;
　　ii.加入500ul的Binding Buffer重悬细胞;
　　iii.加入5ul的AnnexinⅤ-FITC和5ul的PI，震荡混匀;
　　iv.室温避光孵育10-20min;
　　v.用流式细胞仪检测。
　　1.2阿帕替尼治疗恶性黑色素瘤体内实验研究（小鼠模型）
　　1)构建C57BL/6小鼠黑色素瘤B16皮下移植瘤模型，并随机分成六组。
　　2)单药达卡巴嗪，单药阿帕替尼（50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg），达卡巴嗪联合阿帕替尼以及生理盐水（对照组）分别用于C57BL/6小鼠，计算肿瘤生长抑制率，对比阿帕替尼与达卡巴嗪的疗效，并确定阿帕替尼单药最佳有效剂量。
　　3)动物体重及肿瘤体积均用mean±SD表示，使用SPSS10.0软件进行统计学分析，多组间比较采用单因素方差分析，p＜0.05表示差异具有统计学意义。
　　2阿帕替尼治疗不同类型（黏膜型和非黏膜型）多线治疗失败的恶性黑色素瘤的安全性及有效性（临床观察）
　　2.1阿帕替尼对晚期黑色素瘤的安全性及有效性的临床研究
　　2.1.1收集我院15例多线治疗失败后，接受甲磺酸阿帕替尼治疗的晚期难治性黑色素瘤的临床资料。
　　2.1.2治疗方案:患者服用阿帕替尼的起始剂量均为500mg/天，如果患者出现不能耐受的不良反应，则将剂量调整为250mg/天，28天为一个治疗周期。
　　2.1.3统计分析患者治疗后的总生存期(overall survival，OS)，无进展生存期(Progress Free Survival，PFS)，客观反映率(overall response rate，ORR)和疾病控制率(disease control rate，DCR)，并评价患者的不良反应。
　　2.1.4分别比较黏膜型及非黏膜型患者的有效性及安全性。
　　2.1.5统计学分析采用SPSS21.0软件进行。采用Fisher确切概率法及卡方检验比较不同组之间患者人口学特征的差异。单因素生存分析采用Kaplan-Meier法和Log rank检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
　　2.2晚期黏膜型、非黏膜型黑色素瘤的临床病理特征及预后的临床研究（回顾性分析）
　　2.2.1收集我院2010年1月1日至2016年12月31日收治的162例晚期（Ⅲ、Ⅳ期）黑色素瘤患者的临床资料。
　　2.2.2分别比较黏膜型和非黏膜型黑色素瘤患者的临床病理特征、转移模式的区别，并分析二者预后的差异。
　　2.2.3统计学分析采用SPSS21.0软件进行。单因素生存分析采用Kaplan-Meier法和Log rank检验，多因素分析采用Cox比例风险回归模型，以P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果:
　　1阿帕替尼治疗恶性黑色素瘤的实验研究
　　1.1阿帕替尼对恶性黑色素瘤细胞增殖的抑制（体外实验研究）
　　1.1.1细胞增殖抑制实验结果显示，对黑色素瘤细胞系B16单独应用达卡巴嗪，随着药物浓度的升高，抑制率显著升高。对于阿帕替尼组，当药物浓度为50uM时，抑制率较5uM时显著提高，但进一步增加浓度为100uM时，抑制率没有明显的提升。联合用药组采用10ug/ml达卡巴嗪联合不同浓度阿帕替尼，我们发现，相比单独应用达卡巴嗪，联合阿帕替尼用药对B16细胞增殖的抑制率显著提高。然而联合用药与单独应用中浓度(50uM)或高浓度阿帕替尼相比，单独应用阿帕替尼的抑制率反而更高。仅在达卡巴嗪联合低浓度(5uM)阿帕替尼时，联合用药效果优于单独应用5uM阿帕替尼。
　　1.1.2为了进一步研究阿帕替尼对细胞的增殖抑制作用的机制，我们对加药处理后的细胞周期变化进行了检测。低浓度达卡巴嗪对细胞周期的阻滞作用不明显，阿帕替尼组及阿帕替尼联合低浓度达卡巴嗪组均对细胞周期有一定的阻滞作用，可将细胞阻滞于G0/G1期，且联合用药后显示一定程度的协同作用。结果显示，阿帕替尼可通过抑制B16细胞DNA的合成，抑制B16细胞的增殖。
　　1.1.3细胞增殖抑制实验结果提示，阿帕替尼对B16细胞有显著的生长抑制作用。为了进一步确定细胞的死亡方式，我们利用流式细胞术检测加药处理后细胞的凋亡情况。与对照组相比，达卡巴嗪组显示其对细胞没有明显的诱导凋亡作用，其凋亡率为7.04％;阿帕替尼组细胞凋亡率明显升高为14.49％;联合用药组细胞凋亡率最高，为24.7％。结果显示，阿帕替尼可诱导黑色素瘤细胞系B16发生凋亡，当其与低浓度达卡巴嗪联合时，其诱导凋亡作用可进一步提高。
　　1.2阿帕替尼治疗恶性黑色素瘤效果（体内实验研究，小鼠模型）
　　1.2.1阿帕替尼对小鼠黑色素瘤B16皮下移植瘤的生长具有明显的抑制作用，且抑制作用与剂量呈正相关。在一定范围内（50mg/kg-200mg/kg），阿帕替尼的剂量越大，肿瘤生长抑制率越高。
　　1.2.2阿帕替尼对移植瘤的抑制作用要强于达卡巴嗪。
　　2阿帕替尼治疗不同类型（黏膜型和非黏膜型）多线治疗失败的恶性黑色素瘤的安全性及有效性（临床观察）
　　2.1阿帕替尼对晚期黑色素瘤的安全性及有效性的临床观察
　　2.1.1整体患者的OS为8.0个月，PFS为3.7个月，ORR为6.7％(1/15)，DCR为80.0％(12/15)。
　　2.1.2黏膜型和非黏膜型患者的OS分别达到14.5、4.5个月(HR0.014，95％CI0.000-12.735，P=0.022)，而二者的PFS分别为8.0、2.8个月(HR0.095，95％CI0.011-0.816，P=0.011)。黏膜型和非黏膜型患者的ORR分别为20％、0％，DCR分别为100％、70％。
　　2.1.3治疗中3级不良反应分别为高血压(13.3％)、手足综合征(6.7％)、蛋白尿(6.7％)和胆红素升高(6.7％)。
　　2.2晚期黏膜型、非黏膜型黑色素瘤的临床病理特征及预后的临床观察
　　2.2.1黏膜型、非黏膜型患者中位PFS分别为13、8个月(P=0.005)。
　　2.2.2亚组分析表明，单纯免疫治疗组黏膜型、非黏膜型患者中位PFS分别为14个月、10个月(P=0.022);单纯化疗组黏膜型、非黏膜型患者中位PFS分别为6个月、4个月(P=0.040)。多因素分析表明，年龄为影响黏膜型黑色素瘤患者PFS的独立危险因素，分期和治疗方案为影响非黏膜型黑色素瘤患者PFS的独立危险因素。
　　2.2.3黏膜型、非黏膜型黑色素瘤最常见的转移器官均为肺部(29.3vs28.9)，其次分别为肝脏(14.6vs12.7)和脑(9.8vs8.3)，二者之间的差异无统计学意义。
　　结论:
　　1.体外实验研究表明，阿帕替尼能够显著抑制小鼠黑色素瘤B16细胞系的增殖，且抑制作用与浓度呈正相关。阿帕替尼可抑制黑色素瘤细胞系B16的DNA合成。阿帕替尼可诱导黑色素瘤细胞系B16发生凋亡。
　　2.体内实验研究表明，阿帕替尼对小鼠黑色素瘤B16皮下移植瘤生长的抑制作用强于达卡巴嗪，且抑制作用具有剂量依赖性。
　　3.对于多线治疗失败的难治性黑色素瘤，阿帕替尼可能是有效、安全的，且相较于非黏膜患者，黏膜型黑色素瘤患者预后更好;晚期黏膜型黑色素瘤患者预后比晚期非黏膜型患者更好，二者的临床病理特征之间存在巨大差异。

目录

声明

摘要

中英文缩略词表

引言

1 黑色素瘤是一种恶性程度很高的肿瘤，具有很大的异质性和种族性差异

2 黑色素瘤是一种富血管肿瘤，抗血管生成治疗是一种很有前途的治疗策略

3 甲磺酸阿帕替尼作为一种新型小分子酪氨酸激酶抑制剂，对多种肿瘤均具有良好的疗效

材料、方法与结果

第一部分 阿帕替尼治疗恶性黑色素瘤的实验研究

1 阿帕替尼对恶性黑色素瘤细胞增殖的抑制(体外实验研究)

2 阿帕替尼治疗恶性黑色素瘤效果(体内实验研究，小鼠模型)

第二部分 阿帕替尼治疗不同类型(黏膜型和非黏膜型)多线治疗失败的恶性黑色素瘤的安全性及有效性(临床观察)

1 阿帕替尼对多线治疗失败的晚期黑色素瘤的安全性及有效性的临床观察

2 BRAF基因突变状态与阿帕替尼临床疗效的关系

3 晚期黏膜型、非黏膜型黑色素瘤的临床病理特征及预后的临床观察

讨论

1 阿帕替尼能够抑制黑色素瘤细胞系B16的增殖并诱导其凋亡

2 甲磺酸阿帕替尼对黑色素瘤具有可靠的安全性及疗效，而且对于黏膜型黑色素瘤的疗效优于非黏膜型黑色素瘤

3 黏膜型黑色素瘤与非黏膜型黑色素瘤的临床病理特征及预后具有明显的差异

参考文献

综述

个人简历

博士研究生期间发表论文、研究成果

致谢