靶向载药聚乳酸超声造影剂微泡的研究

摘要

目的：制备和表征氧化石墨烯（GO）修饰的载阿霉素（DOX）聚乳酸（PLA）微泡，考察此药物递送体系体内外超声显影效果、对人乳腺癌MCF-7细胞体外活性影响以及在小鼠体内急性毒性情况。 方法：采用改良的Hummer’s法制备氧化石墨烯，合成氧化石墨烯与聚乙烯醇（PVA）的偶联物（GO-PVA）并进行表征。以阿霉素（DOX）作为模型药物，采用复乳化-溶剂挥发法联合酰胺反应制备叶酸（FA）修饰的载阿霉素PLA复合微泡超声造影剂（FA-DOX/GO-DOX/PLA）。以PLA浓度、PVA浓度、PVA用量、异丙醇浓度为考察对象，以微泡的外观形态、粒径、稳定性为评价指标，通过L9（34）正交试验筛选制备微泡的最优处方，以初乳和复乳的制备超声功率、磁力搅拌时间、离心转速为考察对象，以微泡的外观形态、粒径、稳定性为评价指标，通过L9（34）正交试验筛选制备微泡的最佳制备工艺。随后，对FA-DOX/GO-DOX/PLA复合微泡的外观形态、粒径、Zeta电位以及复合微泡中DOX和GO的负载率进行表征。采用CCK-8法检测FA-DOX/GO-DOX/PLA复合微泡对乳腺癌MCF-7细胞的体外增殖抑制情况。采用吖啶橙染色观察药物作用后乳腺癌MCF-7细胞的活性。采用一次性腹腔注射复合微泡的方式进行染毒观察KM小鼠毒性反应及死亡情况，寇氏法计算LD50及95％置信区间。采用多普勒彩色超声成像系统观察复合微泡体内外超声显影效果。 结果：FA-DOX/GO-DOX/PLA复合微泡的最优处方为PLA浓度0.06g?mL-1、PVA浓度3.50％、PVA（3.50％）用量40mL、异丙醇浓度5.50％；最佳制备工艺为初乳制备超声功率120W、复乳制备超声功率210W、磁力搅拌时间2.5h、离心转速2400r min-1。根据筛选出的最优处方及最佳制备工艺制备的FA-DOX/GO-DOX/PLA复合微泡呈规则圆整的球形，粒径分布集中，平均粒度为600nm左右，Zeta电位为(-37.50 10.00)mV，复合微泡中DOX负载率为（7.42 0.62）％，GO负载率为（19.56 0.27）％。体外细胞实验表明在同一药物浓度水平下，不同给药组对肿瘤细胞均呈剂量依赖性，且FA-DOX/GO-DOX/PLA微泡、载药GO修饰复合PLA微泡（DOX/GO-DOX/PLA微泡）、载药PLA微泡（DOX/PLA微泡）、载药GO修饰空白PLA微泡（DOX/GO-PLA微泡）和free DOX组对MCF-7细胞的增殖抑制作用依次递减，具有统计学意义。通过采用吖啶橙（AO）荧光染色后观察发现，不同给药组均对细胞活性产生抑制作用，诱导凋亡，但FA-DOX/GO-DOX/PLA复合微泡对细胞的抑制作用强于其他各给药组。小鼠急性毒性试验中，采用寇氏法计算复合微泡的半数致死量，小鼠经腹腔注射复合微泡的LD50为87.53mg kg-1，95％置信区间为（74.25~103.19）mg kg-1。体内外超声显影评价中，采用多普勒彩色超声成像系统检测到复合微泡超声造影剂体外成像效果显著强于对照组，复合微泡超声造影剂在新西兰兔主要器官中具有良好的超声显影效果，且能够安全顺利的在体内进行循环。 结论：通过复乳化-溶剂挥发法、L9（34）正交试验制备的FA-DOX/GO-DOX/PLA复合微泡粒径、Zeta电位、包封率、载药量及稳定性较好。体外细胞实验表明，与其他给药组相比，FA的修饰可以通过与细胞表面FA受体特异性结合极大提高阿霉素对乳腺癌MCF-7细胞的细胞毒性。一次性腹腔注射复合微泡后，复合微泡对KM小鼠的精神状况、行为动作均无明显毒性，具备生物安全性。复合微泡体内外超声造影效果显著增强。因此，本课题初步证实FA-DOX/GO-DOX/PLA复合微泡是一种具有广阔应用前景的靶向递药系统。

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