洛克沙胂完全抗原的制备及其单克隆抗体的研制

摘要

洛克沙胂（Roxarsone，ROX）是有机砷制剂的一种，由于它具有抗球虫，促进生长等作用，被广泛应用于畜禽养殖中。但随着科学技术的发展，人们逐渐意识到了ROX带来的不良影响，欧盟、美国、中国都相继禁止ROX的使用或者规定了ROX的最低检测限，因此必须建立ROX的快速检测方法。目前检测ROX最常用的方法仍是仪器检测法，包括色谱法和质谱法等，但这些方法需要昂贵的仪器设备，且需专业人员进行操作；而免疫学快速检测方法具有快速，特异，且能大批量检测样品的特点，对ROX的现场快速筛查具有重要的意义。优质的抗体是建立免疫学快速检测方法的关键，目前针对ROX的免疫学快速检测方法主要是以多克隆抗体作为检测抗体，尚未有ROX单克隆抗体检测产品的相关报导。本研究旨在研制出高特异性、高灵敏度的抗体，为建立ROX免疫学快速检测方法打下基础。 本研究以ROX的结构类似物3-氨基-4-羟基苯胂酸（HAPA）作为ROX的替代物，用碳二亚胺（EDC）将BSA与HAPA通过酰胺键相连，制备人工合成抗原HAPA-BSA；用戊二醛将OVA与HAPA的伯氨基相连，制备用于检验的包被抗原HAPA-OVA。用紫外扫描、SDS-PAGE鉴定合成的HAPA-BSA和HAPA-OVA，结果证明HAPA与BSA、OVA分别连接成功。用HAPA-BSA免疫3只小鼠，收集四次免疫后血清，测定效价为1∶6.4×103，IC50值为63.533μg/mL。 利用细胞融合技术制备杂交瘤细胞，有限稀释法对阳性细胞亚克隆，筛选出一株可以稳定分泌抗ROX抗体的杂交瘤细胞株，命名为3G12。收集3G12细胞株培养液，间接ELISA测定效价为1∶5.12×102，IC50值为3.147μg/mL。随后以腹腔诱生腹水法大量制备单克隆抗体，收集腹水并用辛酸-硫酸铵法纯化，SDS-PAGE结果表明纯化后条带单一；间接ELISA测定纯化前后腹水效价，结果显示纯化前后腹水效价均可达到1∶1.024×105，纯化后腹水的IC50值为1.433μg/mL。综上所述本研究成功研制得到了抗ROX的单克隆抗体，为建立ROX的免疫学快速检测方法奠定了基础。

目录

声明

1 文献综述

1.1 前言

1.2 洛克沙胂简介

1.2.1 洛克沙胂的理化性质

1.2.2 洛克沙胂的用途

1.2.3 洛克沙胂使用历程

1.2.4 洛克沙胂的残留危害

1.3 洛克沙胂的检测方法

1.3.1 高效液相色谱法检测洛克沙胂

1.3.2 高效液相色谱－电感耦合等离子质谱法检测洛克沙胂

1.3.3 免疫学法检测洛克沙胂

1.4 完全抗原制备的理论基础

1.4.1 半抗原的选择

1.4.2 偶联方法的选择

1.5 完全抗原的鉴定

1.5.1 质谱法鉴定完全抗原

1.5.2 核磁共振法鉴定完全抗原

1.6 抗体的研制

1.6.1 动物免疫

1.6.2 单克隆抗体制备

1.7 酶联免疫吸附试验简介

1.7.1 间接竞争ELISA

1.7.2 异源间接竞争ELISA

1.8 研究的目的和意义

2 人工完全抗原的合成与鉴定

2.1 材料

2.1.1 实验仪器

2.1.2 主要试剂及耗材

2.1.3 实验主要试剂

2.1.4 实验动物

2.2 实验方法

2.2.1 完全抗原的制备

2.2.2 完全抗原浓度测定

2.2.3 完全抗原的鉴定

2.2.4 完全抗原的免疫效果评价

2.3 实验结果

2.3.1 完全抗原浓度测定

2.3.2 完全抗原的紫外扫描鉴定

2.3.3 完全抗原的SDS-PAGE鉴定

2.3.4 免疫学检测

2.4 讨论

2.4.1 偶联方法的选择

2.4.2 人工完全抗原鉴定方法的选择

2.5 小结

3 单克隆抗体的研制

3.1 实验材料

3.1.1 实验仪器

3.1.2 主要试剂及耗材

3.1.3 实验溶液

3.1.4 实验动物、细胞

3.2 实验方法

3.2.1 1640培养基的配制

3.2.2 SP2/0细胞的培养

3.2.3 待融合小鼠的选择及其超免

3.2.4 小鼠饲养细胞的制备

3.2.5 细胞融合

3.2.6 阳性杂交瘤细胞的筛选

3.2.7 阳性杂交瘤细胞的亚克隆

3.2.8 阳性杂交瘤细胞的扩大培养与冻存

3.2.9 杂交瘤细胞株效价及其敏感性的测定

3.2.10 单抗腹水的制备

3.2.11 单抗腹水的纯化

3.2.12 单抗浓度与纯度的检测

3.2.13 单抗效价与敏感性的测定

3.2.14 单抗亲和力的测定

3.2.15 单抗交叉反应率（CR）的测定

3.3 结果

3.3.1 杂交瘤细胞株的建立

3.3.2 杂交瘤细胞上清效价及敏感性测定

3.3.3 单抗浓度及纯度鉴定

3.3.4 单抗效价及敏感性测定

3.3.5 单抗亲和力测定

3.3.6 单抗交叉反应性的测定

3.4 讨论

3.4.1 杂交瘤细胞株的筛选

3.4.2 单克隆抗体研制过程中采用异源竞争ELISA筛选阳性细胞株

3.5 小结

4 实验结论

参考文献

附录 英文缩写词汇表

致谢

个人简历