启动子区SNPs及DNA甲基化对缺血性脑卒中患者ABCA1基因表达的调控机制研究

摘要

研究目的： 缺血性脑卒中（Ischemic Stroke,IS）是由于脑部供血动脉管腔的阻塞或狭窄，导致血液灌流区的局部脑组织缺血、缺氧或坏死而产生的一系列症状的临床疾病。中国属于IS的高发国家，其发病率、致残率及死亡率较高，给个体、家庭和社会带来了沉重的负担。 动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）的形成和发展是IS发生的重要病理生理基础，而循环血中的单核细胞在损伤内膜处聚集并粘附到血管内皮是脂质条纹形成进而发展成为AS的关键步骤。泡沫细胞是早期动脉粥样硬化典型的病理性细胞。胆固醇逆转运（Reverse cholesterol transport,RCT）对于维持细胞内的脂质平衡以及预防AS的形成具有重要作用。三磷酸腺苷结合体转运蛋白（ATP binding cassette subfamily A1,ABCA1）是形成成熟高密度脂蛋白的关键性蛋白，并且可以抑制动脉粥样硬化过程当中所产生的炎症反应。 DNA甲基化影响基因的表达从而参与疾病的发生发展，这为研究疾病的发病机制提供了新的思路。DNA甲基化是指存在于基因组DNA分子的胞嘧啶在DNA甲基化转移酶（DNA methyltransferase,DNMT）作用下将S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine,SAM）作为甲基供源，形成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine,5-mC），从而发生甲基化。在高等真核生物中，存在于启动子区的CpG岛通常处于未发生甲基化的状态，但是当在一些疾病状态下，启动子区的甲基化状态则会发生改变，从而调节基因的表达情况。 Gomez-Uriz等采用甲基化微阵列分析法，通过病例-对照研究发现，脑卒中患者中有80个CpG位点的甲基化水平存在差异，该研究认为DNA甲基化的差异可以作为脑卒中的潜在标志物。本课题组前期应用MethylTarget目的区域甲基化测序的方法对20例IS患者和20例对照个体进行ABCA1基因启动子区甲基化检测，初步发现病例组中ABCA1基因启动子区的甲基化水平要显著低于对照组，差异具有统计学意义。推测ABCA1基因启动子区的甲基化水平可能参与调节ABCA1基因的表达，影响细胞内脂质和胆固醇的清除速率，进而参与IS的病理进程。 有研究表明，单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）位点可能会影响基因组CpG岛区域的DNA甲基化水平或调控基因的表达，进而参与疾病的发生、发展。但是，目前在缺血性脑卒中患者中ABCA1基因启动子区的SNP位点对该基因的相对表达量以及CpG位点的甲基化水平的影响尚有待进一步探究。 综上所述，本课题提出如下假说：ABCA1基因启动子区的SNPs位点通过影响该基因CpG位点的DNA甲基化水平，参与调节ABCA1基因的表达，并通过影响细胞内脂质和胆固醇的清除速率，参与IS的病理进程。本研究将揭示SNPs及DNA甲基化对ABCA1基因表达的影响，为IS发生的遗传学机制及人群防治提供新的理论依据。 方法： 第一部分 ABCA1基因启动子区SNPs及DNA甲基化调控缺血性脑卒中患者外周血mRNA的表达 研究对象： 本研究方案已经通过郑州大学、河南中医药大学第一附属医院伦理委员会批准，所有研究对象均为河南汉族人群，并且均签署了知情同意书。 1.检测ABCA1基因mRNA表达的研究对象 病例组选取2017年10月至2018年3月在河南中医药大学第一附属医院的住院IS患者100例。其中男性患者54例，所占比例54%，女性患者46例，所占比例46%，病例组平均年龄59.18±11.79岁。所有患者的诊断结果均是依据WHO所制定的IS诊断标准，患者均接受了临床上的各项检查（病史、临床生化指标、体征、CT或者MRI等），并排除了瓣膜性心脏病、房颤、血液病、恶性肿瘤、癫痫、细菌性感染等患者。对照组选取的是与IS患者同批次进行体检的个体共100例。其中男性48例，所占比例48%，女性52例，所占比例52%，对照组平均年龄57.37±12.32岁。 2.检测ABCA1基因启动子区甲基化、SNP分型的研究对象 该部分研究对象同ABCA1基因mRNA表达检测的研究对象。 方法： 1.采用北京天根公司的批号DP443高效血液总RNA提取试剂盒提取外周血总RNA，并进行反转录成cDNA，应用荧光定量RT-PCR技术对ABCA1基因的mRNA相对表达水平进行分析。 2.采用北京天根公司的批号DP332血液基因组提取试剂盒提取DNA，运用MethylTarget目的区域甲基化测序的方法对ABCA1基因启动子区的CpG位点进行DNA甲基化水平的检测与分析。 3.采用KASP基因分型技术对rs2246298、rs1800976、rs1800977、rs2437817、rs539621172、rs2740483位点进行基因分型，并比较不同基因型个体间DNA甲基化水平及ABCA1基因mRNA表达水平之间的差异。 结果： 1.IS组ABCA1基因的mRNA表达水平显著高于对照组（P<0.05）。 2.IS组ABCA1基因启动子区的平均甲基化水平显著低于对照组（P＜0.05），性别分层分析后发现病例、对照组之间无显著性差异（P＞0.05）。 3.在病例-对照中ABCA1基因启动子区rs2246298位点和rs1800977位点与CpG位点甲基化水平呈现显著相关性。 4.在病例-对照中ABCA1基因启动子区rs1800976、rs1800977、rs2246298、rs2437817、rs2740483等5个SNP位点的不同基因型与ABCA1基因mRNA相对表达量之间无显著相关性（P＞0.05）。 第二部分 泡沫细胞模型中ABCA1基因启动子区DNA甲基化对基因表达的影响 实验材料： 人单核细胞THP-1细胞系以及THP-1源泡沫细胞 方法： 1.采用北京天根公司的细胞基因组DNA提取试剂盒，提取细胞中总DNA，运用MethylTarget目的区域甲基化测序的方法对ABCA1基因启动子区的CpG位点进行DNA甲基化水平的检测与分析。 2.采用北京天根公司的细胞基因组RNA提取试剂盒，提取细胞中总RNA，进行反转录成cDNA，应用荧光定量RT-PCR技术对细胞中ABCA1基因的mRNA相对表达水平进行分析。 3.采用北京索莱宝公司的细胞组织蛋白提取试剂盒，提取细胞总蛋白，并对提取的蛋白进行定量检测。 结果： 1.THP-1细胞组ABCA1基因的mRNA表达量显著低于THP-1源泡沫细胞组（P＜0.05）。 2.THP-1细胞组ABCA1基因启动子平均甲基化水平与THP-1源泡沫细胞组无显著性差异（P＞0.05）。 3.THP-1细胞泡沫化后启动区CpG1、CpG11、CpG16位点的甲基化程度发生显著性降低（P＜0.05）。 4.THP-1细胞泡沫化后ABCA1蛋白表达量相较于THP-1细胞系显著升高（P＜0.05）。 结论： 1.ABCA1基因启动子区低甲基化状态与缺血性脑卒中的发生密切相关。 2.ABCA1基因启动子区SNP位点（rs2246298位点、rs1800977位点）与CpG位点甲基化水平显著相关（P＜0.05），可作为缺血性脑卒中的潜在标志物。

目录

声明

中英文缩略词汇对照表

前言

第一部分 ABCA1基因启动子区SNPs及DNA甲基化调控缺血性脑卒中患者外周血mRNA的表达

1 材料与方法

1.1 研究对象

1.2 实验试剂及仪器

1.3 实验方法

1.4 统计方法

2 结果

2.1 IS病例-对照人群临床样本特征的比较

2.2 比较IS组和对照组中ABCA1基因mRNA表达水平

2.3 比较IS组和对照组ABCA1基因启动子区DNA甲基化的差异

2.4 ABCA1基因启动子区SNPs位点与CpG位点甲基化水平相关性分析

2.5 ABCA1基因启动子区SNPs位点不同基因型对基因表达水平的影响

3 讨论

4 结论

第二部分 泡沫细胞模型中ABCA1基因启动子区DNA甲基化对基因表达的影响

1 材料和方法

1.1 实验细胞

1.2实验试剂及仪器

1.3 主要试剂的配制

1.4实验方法

1.5统计方法

2 实验结果

2.1 诱导THP-1泡沫细胞模型

2.2 THP-1细胞发生泡沫化过程中ABCA1基因mRNA表达

2.3 THP-1细胞在泡沫化过程中启动子区DNA甲基化的改变

2.4 THP-1细胞泡沫化对ABCA1蛋白表达量的影响

3 讨论

4 结论

参考文献

综述:ABCA亚家族在人类遗传性疾病中的研究进展

参考文献

个人简历

致谢