黄河鲤卵巢发育抑制性消减杂交文库的构建和相关基因的结构及功能分析

摘要

生物在其生命周期中，基因按时间和空间的顺序有序地进行表达，从而也决定了生命活动的多样性和复杂性。在鱼类性腺发育过程中，基因的时空表达方式也受到严格而精确的调控，不同的发育阶段，其表达基因各不相同。通过比较卵巢不同发育时期的基因表达差异，即可能寻找到与卵巢发育密切相关的基因，因此，本文选取黄河鲤不同发育时期的卵巢进行差异基因研究。本研究从mRNA水平上，分别以未分化性腺和二期卵巢为验证方(Tester)，以成鱼卵巢为驱动方(Driver)，构建抑制性消减杂交文库;利用Sorthern斑点杂交筛选后测序得到文库中的序列。借助GO信号通路分析其功能，从中选取与卵巢发育相关的候选基因，利用实时荧光定量qRT-PCR验证其表达。进而挑选Bmp基因进行详细研究，结合已有的黄河鲤转录组文库验证得到Bmp家族12个基因的cDNA序列，通过qRT-PCR分析其表达情况，挑选Bmp2、Bmp4和Bmp15进行深入研究。借助鲤鱼基因组信息对Bmp2、Bmp4和Bmp15所在染色体的基因结构、染色体同线性分析，通过组织原位杂交和免疫组织化学染色方法对其进行时空表达定位;利用Bmp信号通路抑制剂DSM体外处理性腺，初步探究Bmp信号通路对黄河鲤性别分化和早期卵巢发育的作用。
　　本研究主要内容包括：⑴成功构建黄河鲤鱼未分化性腺和二期卵巢的抑制性消减杂交文库，经过转化摇菌，两个文库一共得到约1200个单克隆，用巢式PCR进行初步筛选，得到约600个含有插入片段的阳性克隆;之后借助Sorthern斑点杂交，进一步验证选出差异显著的150个克隆送公司测序。⑵测序得到的序列进行生物信息学分析，在Genebank中进行Blast比对，除去重复和一些微卫星序列，两个库共得到78个unigene。GO分析文库基因的生物信号通路，分类分属17类，其中较多基因ESTs序列分属于蛋白质水解作用，信号转导、细胞分化和转化生长等。结合其基因功能分析和相关研究，选取与卵巢发育相关的22个候选基因（Bmp2，Pvalb, Midlip1l,Pax2，Zgc，Desmin，Bmp4等）进行文库验证，并对其功能进行初步分析。⑶选取可能参与卵巢发育的Bmp家族基因，在黄河鲤鱼未分化性腺、幼鱼和成鱼雌雄性腺中对其表达模式定量分析，发现Bmp2、Bmp4和Bmp15分别在二期卵巢、未分化性腺和成熟卵巢中有高表达，故挑选Bmp2、Bmp4和Bmp15进行深入研究，验证得出Bmp2、Bmp4和Bmp15分别为2068、2037、2165的全长序列，各编码410、399和384个氨基酸，且羧基端均含有TGF-β结构域。分析基因Bmp4基因在基因组骨架上有一个重复出现，且其同线性分析染色体位置和其他物种差异较大。Bmp2和Bmp15分别位于黄河鲤第40号染色体和第5号染色体，同线性分析展示了和斑马鱼高度的进化相似性。⑷原位杂交和免疫组化定位发现Bmp2、Bmp4和Bmp15三个基因表达位置相似，在二期卵巢中均集中在细胞质中表达，成熟卵巢时期集中表达在卵泡周围的皮质小泡中，结合其表达量推测Bmp2是黄河鲤卵巢早期发育的重要调控基因;Bmp15基因则作为卵泡早期生长调控基因可能参与黄河鲤卵巢中卵泡大小的发育。⑸黄河鲤鱼未分化性腺中Bmp信号通路受到DSM成功抑制后，三个雄性标志基因(Amh，Dmrt1，Sox9a)在高浓度或者高剂量时出现显著或极显著表达上调，雌性基因Cyp19和Foxl2表达量显著降低，性腺在分子水平上出现偏向雄性分化的趋势，说明Bmp信号通路对于未分化性腺向雌雄分化起重要调节作用;对二期卵巢处理后也显示出抑制卵巢发育，故推测Bmp信号通路对于维持雌性卵巢早期正常发育有着重要的作用。

目录

摘要

1 前言

1．1 鱼类卵巢发育研究进展

1．1．1 鱼类卵巢发育过程研究

1．1．2 鱼类卵巢发育相关基因的研究

1．1．3 鱼类卵巢发育的调控通路

1．2 Bmp基因家族研究概述

1．2．1 Bmp基因的发现和特征

1．2．2 Bmp家族基因的研究现状

1．2．3 Bmp信号通路

1．2．4 Bmp信号通路抑制剂

1．3 抑制消减杂交技术

1．4 本研究的目的意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 宿主菌株和载体

2．1．3 主要仪器设备

2．1．4 主要试剂

2．1．5 常用溶液的配制

2．1．6 实验所用引物

2．2 方法

2．2．1 组织切片的制备

2．2．2 总RNA的提取和普通反转录

2．2．3 抑制性消减杂交

2．2．4 杂交产物的克隆

2．2．5 Southern斑点杂交

2．2．6 SSH文库测序结果的生物信息学分析

2．2．7 序列分析和进化树的构建

2．2．8 Quantitative real-time PCR(qRT-PCR)及数据分析

2．2．9 免疫组织化学染色

2．2．10 原位杂交

2．2．11 体外组织培养DSM抑制Bmp通路

2．2．11 图像采集

3 结果

3．1 黄河鲤鱼卵巢发育的基本过程

3．2 黄河鲤鱼卵巢发育抑制性削减杂交文库构建

3．2．1 总RNA的获得

3．2．2 第二链cDNA的合成和酶切纯化

3．2．3 接头连接效率检测

3．2．4 抑制消减杂交产物的获得及消减杂交效率的检测

3．2．4 杂交产物中阳性克隆的鉴定

3．2．5 Southern斑点杂交筛选

3．3 SSH文库测序结果的生物信息学分析

3．4 qRT-PCR对差异表达候选克隆筛选验证

3．5 黄河鲤鱼Bmp家族基因表达分析

3．6 黄河鲤鱼Bmp2、Bmp4和Bmp15基因序列和位置结构分析

3．7 黄河鲤鱼Bmp2、Bmp4和Bmp15基因表达定位分析

3．7．1 基因RNA探针的制备和标记效率的检测

3．7．2 基因的原位杂交和免疫组化结果与分析

3．8 黄河鲤鱼Bmp信号通路对卵巢发育的作用研究

3．8．1 DSM药物抑制未分化性腺后基因的表达分析

3．8．2 DSM药物抑制二期卵巢后基因的表达分析

4 讨论

4．1 黄河鲤鱼卵巢发育SSH文库的生物信息学分析

4．2 黄河鲤鱼卵巢发育相关基因表达及功能预测

4．3 黄河鲤Bmp家族基因的序列保守性和表达分析

4．4 黄河鲤鱼Bmp2、Bmp4和Bmp15基因表达定位分析

4．5 Bmp信号通路对黄河鲤鱼卵巢发育的作用研究

4．5．1 Bmp信号通路对黄河鲤鱼未分化性腺的作用研究

4．5．2 Bmp信号通路对黄河鲤鱼二期卵巢的作用研究

参考文献

附录

致谢

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