PRRSV GP2和M蛋白免疫活性及其在感染细胞内分布的初步研究

摘要

猪繁殖与呼吸综合征（PorcineReproductiveandRespirationSyndrome，PRRS）是以妊娠母猪繁殖障碍及各年龄阶段猪呼吸道症状为主要特征的传染病。其病原猪繁殖与呼吸综合征病毒（PorcineReproductiveandRespirationSyndrome，PRRSV）基因组中一共有6种结构蛋白基因，分别由ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7基因编码病毒的GP2、GP3、GP4、GP5、M蛋白和N蛋白，其中M蛋白是主要结构蛋白，具有很强的免疫原性，用体外表达的重组M蛋白可以作为血清学试验的靶抗原，但是，该蛋白的结构和功能还不是很清楚；GP2蛋白是次要结构蛋白，目前关于GP2蛋白功能研究的报道仍然很少。所以本实验对PRRSVHn-1/06株的GP2和M蛋白进行了初步研究。 本研究利用RT-PCR从PRRSV河南分离株Hn-1/06克隆得到了大小约525bp片段的ORF6基因和771bp片段的ORF2基因，并将扩增的基因片段克隆到pTG19-T载体中进行测序。利用DNAStar软件进行序列分析，结果表明河南分离株Hn-1/06属于美洲型，同时将Hn-1/06株ORF6和ORF2基因的核苷酸序列和推导氨基酸序列与ATCCVR2332、LV、Resp、CH-1a、BJ-4、S1、CC-1、HB-1、JX0612、HUB1等分离株进行了同源性分析，Hn-1/06株与空间距离较近的JX0612、HUB1同源性极高，核苷酸同源性能达到99％以上，推导氨基酸同源性达98％以上；而与空间距离较远的Resp、CC-1同源性次之。这在一定程度上说明了PRRSV的同源性与空间距离密切相关，空间距离越近同源性越高；反之，空间距离越远同源性越小。 根据PRRSV河南分离株Hn-1/06株ORF6和ORF2基因设计表达引物，扩增出两端带有BamH-Ⅰ/HindⅢ酶切位点的ORF6基因和BamHⅠ/XhoⅠ酶切位点的ORF2基因，将其亚克隆到原核表达载体pET32a和pGEX-6p-1中构建了重组表达质粒pET32a-dORF6和pGEX-dORF2，在IPTG的诱导下成功表达，获得了大小分别约为29KD、44KD的融合蛋白rdM和rdGP2，与预期结果相符；通过对表达条件进一步优化，获得了融合蛋白的高效表达。应用纯化的融合蛋白经SDS-PAGE电泳和Westernblot鉴定，目的蛋白纯度高达90％，并具有良好的免疫学活性。 用GP2和M融合蛋白免疫小鼠，获得了鼠抗重组GP2和M蛋白抗体。通过本实验室建立的间接ELISA及IFA方法对鼠抗重组GP2和M蛋白抗体的免疫活性进行检测，结果显示鼠抗GP2和M重组蛋白抗体的效价分别为1：10和1：20，且没有中和活性。用本人建立的IFA方法对GP2和M蛋白在PRRSV感染的Marc-145细胞内的分布进行了检测，结果显示，在PRRSV感染24h即可检测到M蛋白，且可随时间的增加有所增加，但未检测到GP2蛋白。鼠源抗体的制备及IFA方法的建立，为GP2和M蛋白的生物学和免疫学功能方面的研究打下了坚实的基础。

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文摘

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致谢

文献综述

1病原学

2PRRSV的分子生物学特性

3免疫学与致病机制的研究进展

4 RRSV诊断方法

5免疫防制

6结语

引言

试验一:PRRS Hn—1/06株ORF2和ORF6基因的克隆及序列分析

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

试验二:重组GP2和M蛋白的原核表达及其免疫活性的研究

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

试验三:GP2和M蛋白在感染细胞内分布的初步研究

1材料与方法

2结果

3讨论

全文总结

参考文献

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