根癌农杆菌介导的菜心(Brassica campestris L. Subsp. Chinensis Makino var. parachinensis Tsenet Lee)遗传转化与优化研究

摘要

本文以“油青四九”菜心种子为原材料，从获得无菌菜心苗到“油青四九”菜心转化体系的建立，系统地研究了以子叶柄-子叶为外植体的“油青四九”菜心的高频再生体系和根癌农杆菌介导的菜心遗传转化体系及其优化，较成功地获得了转入局EβF基因的“油青四九”菜心植株，并通过了PCR初步鉴定。
　　 试验通过对影响“油青四九”菜心子叶柄-子叶外植体分化不定芽的AgNO3浓度、植物激素及其配比、外植体苗龄等因素的研究，建立了子叶柄-子叶外植体的高效再生体系：在超净工作台中，用纱布包裹着的种子先经70％乙醇浸泡45s，无菌水洗涤3次，0.1％的HgCl2溶液消毒8～10min，期间不停的搅动纱布，使种子与HgCl2溶液充分接触，无菌水洗涤4～5次，无菌滤纸吸干种子表面残留的水分后，均匀接种于盛有1/2MS培养基的无菌培养瓶中，每瓶100粒左右，将培养瓶置于植物组织培养室中，在(25±1)℃、光强1600～，20001x和16h光照/8h黑暗的光周期的培养条件下培养出无菌苗；取3～7d苗龄的无菌苗近生长点处切下子叶柄-子叶外植体接种于1/2倍NH4+浓度的MS培养基的盐类及维生素+4mg/L6-BA+1mg/LNAA+7.5mg/LAgNO3+30g/L蔗糖+8g/L琼脂(pH=5.8)的培养基上，进行光照培养。20d左右外植体开始分化出芽，不定芽分化率为：48.57％。
　　 利用植物遗传转化方法中的根癌农杆菌介导法对“油青四九”菜心子叶柄-子叶外植体的遗传转化与优化加以研究。通过对影响菜心转化率的筛选剂卡那霉素、抑菌剂氨苄青霉素、预培养时间、根癌农杆菌菌液浓度、外植体浸染时间、共培养时间、共培养温度、乙酰丁香酮等因素的研究，建立了一套适用于菜心的可操作的遗传转化体系：取适量保存在-80℃冰箱中的根癌农杆菌pBJ40/LBA菌液于含有50mg/L Str、50mg/LKan、50mg/LRif三种抗生素的LB固体培养基中划线，在恒温培养箱内，28℃过夜培养；挑单菌落根癌农杆菌菌株于含有上述三抗的LB液体培养基中，经28℃下200rpm振荡过夜培养，在菌液的A600值为0.4左右时，离心(4℃，4000r9m，10min)以去除培养基中的高盐浓度及抗生素，收集菌体，用液体MS培养基重悬菌体后所得悬浮液作为浸染菌液；取5d苗龄的无菌菜心苗子叶柄-子叶外植体，预培养2d；将外植体轻轻放入浸染菌液中浸泡10min，除去外植体上的菌液，共培养2d；将外植体转移到含有5mg/L Kan和300mg/L Amp的分化培养基上筛选，20d左右获得抗性再生芽，转化率为2.98％。按照已建立的根癌农杆菌介导的菜心遗传转化体系，获得16棵转化菜心植株，经PCR鉴定，阳性率为87.50％。
　　 文中分别对影响“油青四九”菜心子叶柄-子叶外植体的不定芽分化率和转化率的几种因素进行了讨论，为进一步提高“油青四九”菜心外植体的再生频率和对转入-EβF基因提供了科学参考，为菜心遗传转化、获得新品种的菜心育种工作打下了理论基础。