猪IFITM3基因Piggybac载体构建及其在PK15细胞中的表达

摘要

干扰素是种具有抗病毒、抑制细胞分裂、调节免疫和促进细胞凋亡等多种生物学活性的细胞因子，干扰素通过与其受体结合，诱导细胞内干扰素刺激基因(Interferon Stimulated Genes,ISGs)产生，表达相应的蛋白质从而完成多种生物学功能。干扰素诱导的跨膜蛋白3(Interferon-induced transmembrane protein3，IFITM3)基因是一种重要的干扰素刺激基因。IFITM3具有调节细胞生长分化、细胞增殖和抵御病毒入侵等多种生物学功能。目前对于IFITM3基因的研究主要集中在人和鼠方面，着重于IFITM3基因在肿瘤组织和癌细胞中表达丰度的变化。有关猪IFITM3基因的研究集中在其抗病毒作用方面，具体机制尚不清楚。PiggyBac(PB)转座子能快速高效地将目的基因插入真核细胞基因组中，为在细胞中评价目的基因的功能提供了便利。
　　本文旨在构建猪IFITM3基因的PB转座子重组载体，并初步在PK15细胞中对其表达进行评价，为进一步研究该基因在细胞水平的抗病毒机制奠定前期实验基础。利用RT-PCR方法从猪脾脏组织中对IFITM3基因ORF区进行克降，分析IFITM3基因在猪各组织中的表达，以pET-21b(+)为骨架构建原核重组表达载体，利用SDS-PAGE和Western Blot分析IFITM3基因在大肠杆菌中的融合表达，用PB转座子构建真核重组表达载体PB-IFITM3，将IFITM3基因转染整合到PK15细胞基因组中，QRT-PCR方法检测IFITM3等基因在PK15细胞中的mRNA表达水平，评价IFITM3基因过表达对LPS介导的炎性信号分子表达的影响。结果显示:克隆的猪IFITM3基因长度为438 bp，编码145个氨基酸;IFITM3基因在猪脾脏和肺脏中表达丰度较高;原核表达载体所表达的蛋白大小为22.3ku，其中部分为可溶性蛋白，另一部分以包涵体形式存在;构建了PB-IFITM3真核重组表达载体，实现了IFITM3基因在PK15细胞中的过表达;QRT-PCR结果显示:IFITM3基因过表达后用LPS处理，能进一步上调IFITM3基因表达，且依赖于作用时间;TLR4、NFκB、IFN-α、 IFN-β和TNF-α基因表达显著下调(P＜0.05)，与LPS作用呈现时间依赖性;TBK1、p38 MAPK的基因表达水平略有下调，但在4h和8h时不明显，12h下调明显。提示IHTM3基因过表达能在一定程度上抑制LPS激活的TLR4信号通路。

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致谢

摘要

1 文献综述

1．1 干扰素诱导跨膜蛋白3基因

1．1．1 IFITM基因家族

1．1．2 IFITM基因家族的生物活性

1．1．3 猪IFITM3基因

1．2 PiggyBac转座子

1．3 LPS／TLR4信号通路

1．4 展望

2 引言

3 材料与方法

3．1 试验材料

3．2 试剂

3．3 仪器

3．4 试剂配制

3．4．1 核酸电泳试剂

3．4．2 蛋白电泳试剂

3．4．3 Western Blot试剂

3．4．4 其他试剂配制

3．5 猪IFITM3基因的克隆及组织分布

3．5．1 猪IFITM3基因克隆

3．5．2 组织分布

3．6 猪IFITM3基因原核表达

3．8．1 猪IFITM3基因扩增和鉴定

3．6．2 酶切产物纯化

3．6．3 T4 DNA连接酶连接反应

3．6．4 阳性克隆菌的筛选与鉴定

3．6．5 IFITM3基因在大肠杆菌中诱导表达

3．6．6 融合表达产物的可溶性鉴定

3．6．7 Western Blot分析

3．7 真核表达载体PB-IFITM3构建

3．7．1 引物设计及目的基因扩增

3．7．2 PCR产物胶回收

3．7．3 PB载体和胶回收产物双酶切

3．7．4 酶切产物纯化

3．7．5 T4 DNA连接酶连接反应

3．7．6 连接反应产物转化感受态细胞

3．7．7 PB-IFITM3鉴定

3．7．8 质粒中提

3．8 PB-IFITM3载体在PK15细胞中的表达

3．8．1 稳定细胞系筛选

3．8．2 IFITM3基因过表达检测

3．8．3 猪IFITM3基因过表达对LPS／TLR4信号通路的影响

4 结果与分析

4．1 猪IFITM3基因的克隆与组织分布

4．1．1 猪IFITM3基因克隆

4．1．2 组织分布

4．2 猪巧ITM3基因原核表达

4．2．1 pMD19-IFITM3载体(Sat Ⅰ、Not Ⅰ)构建

4．2．2 pET-21b-WITM3重组载体构建

4．2．3 猪IFITM3基因的诱导表达

4．3 真核表达载体PB-IFITM3构建

4．4 IFITM3在PK15细胞中的表达

4．4．1 稳定细胞系筛选

4．4．2 IFITM3基因过表达

4．4．3 IFITM3基因对LPS／TLR4信号通路的影响

5 结论与讨论

5．1 讨论

5．1．1 猪IFITM3基因克隆、组织分布与原核表达

5．1．2 真核表达载体PB-IFITM3的应用

5．1．3 猪IFITM3基因在PK15细胞的表达

5．2 结论

参考文献