犊牛腹泻病原体沙门氏菌与BVD病毒LAMP检测体系的优化与初步应用

摘要

腹泻是犊牛常见的四季易发疾病，由于犊牛身体娇嫩，内脏器官未发育完全，环境气候的变化以及犊牛的饮食不洁或营养不良都会导致腹泻的发生，当犊牛发生流行性腹泻时，病因主要由微生物感染引起，包括细菌、病毒、寄生虫，病原休感染中最为常见的以细菌和病毒感染居多。当犊牛感染细菌和病毒造成腹泻时，只是依靠粪便状态很难区别，还需要结合流行病学特点、临床症状等进行初步诊断，最终病原分离利用分子生物学方法才能确诊。本实验意义便在于建立一种简单、便捷、特异性强、灵敏度高适用于临床快速检测犊牛腹泻常见病原体的分子生物学方法。
　　1.犊牛腹泻沙门氏菌LAMP检测体系的优化
　　为了建立犊牛腹泻沙门氏菌LAMP检测的最优休系，本实验根据沙门氏菌invA(GI:164523712)基因保守片段设计了4条特异性LAMP引勿，初步建立了沙门氏菌LAMP检测体系。为了对体系进行优化，对反应温度、Mg2-浓度、dNTPs浓度、Bst酶浓度、内外引物的浓度比进行了反复摸索，最终确定了此套沙门氏菌LAMP检测休系的最佳反应温度是64℃，Mg2+、dNTPs浓度、Bst聚合酶浓度分别为8mM、12mM、6U，外引物F3和B3的浓度为0.2μM，最佳引物浓度比为18，即内引物FIP和BIP浓度为1.6μM。该体系特异性较强，2％凝胶电泳发现只有沙门氏菌呈现出了良好的LAMP特征性梯状条带，大肠杆菌、副嗜血杆菌、结核分枝杆菌均无特征性条带。优化后的体系与PCR作比较也显示出了灵敏度高的特点，检测限度比PCR高1-2个数量级（10-100倍）。
　　2.犊牛腹泻BVD病毒LAMP检测体系的优化
　　为了验证LAMP方法对于不同种类的核酸模板均有良好的适用性，本实验根据已经报导的牛病毒性腹泻病毒(BVDv)保守的5'UTR基因（GenBank登录号:AY278459.1）设计了4条特异性引物，同样对LAMP反应体系中的组分和反应条件进行优化，包括Mg2+浓度、反应温度、Bst酶浓度、dNTPs浓度以及引物的浓度比，最终确定了BVD病毒LAMP检测体系的最佳反应温是64℃，Mg2+浓度、dNTPs浓度、Bst聚合酶浓度分别为6mM、16mM、8U，最优内外引物浓度比为16，外引物F3和B3浓度为05μM，内引物FIP和BIP为30μM，AMV反转录酶为1μL、RNA酶抑制剂为05μL。与轮状病毒、冠状病毒对比同样显示出了高度的特异性，优化后的体系比PCR的灵敏度高1-2个数量级。
　　3.犊牛腹泻LAMP检测体系的初步应用
　　前两个实验在前人研究的基础上建立了沙门氏菌和BVD病毒的LAMP检测体系，在试验阶段充分的显示出了LAMP特异性强、灵敏度高的特点，本研究的目的是寻找一种能够适用于临床现场快速检测、简单、便捷的犊牛常见腹泻病原体的分子生物学方法，所以又选取了大肠杆菌、副结核分枝杆菌、轮状病毒、冠状病毒、隐孢子虫和绦虫（同时也建立了沙门氏菌和BVD病毒经典LAMP体系），建立这些病原体的经典LAMP检测体系进行现场检测，来验证LAMP在临床实际应用中的效果。将沙门氏菌和BVD病毒的经典LAMP体系和优化后的LAMP体系比较也能发现，优化后的体系灵敏度有所提高，说明了LAMP检测体系建立完要进行优化才能达到良好的检测效果。由于现场检测时无法进行电泳，对于LAMP产物的可视化检测采用了SYBR GREEN I显色法，显色较为灵敏，并且采用了实验过程中发明的新型染料添加的方法，很好的避免了假阳性的发生。最终将现场LAMP检测的结果与实验室PCR检测结果进行比较，显示出了LAMP方法具有很高的准确度和灵敏度，并且方法简便，不需要使用昂贵仪器，整个反应只需1h左右，可以适用于临床现场的快速检测，在养殖场和基层实验室进行推广，具有广阔的应用前景。

目录

声明

致谢

摘要

文献综述

1 环介导恒温扩增技术基本介绍

1．1 LAMP技术引物

1．2 LAMP引物设计

1．3 LAMP技术的扩增原理

1．4 LAMP方法的特点

1．5 经典LAMP反应体系的建立

1．6 LAMP扩增产物可视化检测

2 LAMP病原体检测在国内外的应用

2．1 细菌的检测

2．2 病毒的检测

2．3 寄生虫的检测

2．4 胚胎性别鉴定方面的应用

2．5 LAMP在其他方面的应用

3 小结

引言

试验一 犊牛腹泻沙门氏菌LAMP检测体系的优化

1．1 实验材料

1．2 试验方法

1．3 LAMP反应和PCR反应的建立

2 结果与分析

2．1 LAMP反应体系的优化结果与分析

3 讨论

3．1 建立LAMP体系时出现的问题

3．2 LAMP反应体系的优化

3．3 LAMP产物可视化检测方法的确立

4 小结

试验二 犊牛腹泻BVD病毒RT-LAMP检测体系的优化

1．1 病料采集

12 主要试剂和仪器

2 试验方法

2．1 病料的处理

2．2 毒液RNA的提取

2．3 BVD病毒RT-LAMP检测体系和RT-PCR体系的建立及优化

3 结果与分析

3．1 LAMP反应体系的优化

4 小结

试验三 LAMP检测体系的初步应用

1 LAMP检测体系初步应用

11 主要试剂和仪器

12 主要溶液的配置

1．3 样本的处理与检测

2 其他病原体LAMP检测

3 结果与分析

小结

参考文献