猪β防御素2对大肠杆菌感染的IPEC-J2细胞NF-κB和MAPK信号通路基因表达的影响

摘要

哺乳动物防御素由于抗菌能力强、抗菌谱广、不易使病原微生物产生耐药性等优点而受到人们广泛关注。因此防御素被认为是一种替代传统抗生素的新型抗微生物制剂，具有广阔的应用前景。猪β防御素2在体外表现出很强的耐盐和热稳定性，较低浓度的pBD2即可对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有很强的杀灭作用。pBD2对炎症反应也有一定作用，但是其调控机制还不清楚。TLRs介导的NF-κB和MAPK信号通路在炎症反应中起关键作用。为了探究pBD2是否通过TLRs介导的信号通路对肠道上皮细胞的炎症反应起作用，本实验利用大肠杆菌感染IPEC-J2细胞，荧光定量检测TLR1-9的表达变化，探索了大肠杆菌感染IPEC-J2细胞最适的浓度和时间。在细胞培养液中添加不同浓度（0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL）的pBD2，分别在培养2h、4h、6h、8h后收集细胞。用荧光定量和蛋白免疫印迹的方法，检测细胞肠道TLRs（Toll-like receptors）和通路蛋白基因的表达量，以期得到防御素对肠道上皮细胞的作用机制。实验结果如下:
　　(1)在大肠杆菌感染IPEC-J2细胞中，最适的感染浓度和时间分别是107和1h。显微镜观察显示:在感染2h后，有少量细胞死亡;在感染4h和8h后，死亡增加;在感染8h后出现成团的死细胞，细胞形态发生变化。肠道紧密连接蛋白ZO-1、ZO-2基因的表达量显著降低，表明大肠杆菌侵染导致细胞屏障受损。
　　(2)在大肠杆感染细胞后，TLRs中只有TLR4、TLR5和TLR7显著升高，IκB-α/NF-κB和TAK1/JNK信号通路中相关基因表达显著升高，炎性因子IL8的表达也显著升高，说明在大肠杆菌感染细胞中TLRs、IκB-α/NF-κB和TAK1/JNK信号通路可能与炎症反应有关。
　　(3)在大肠杆菌感染IPEC-J2细胞中添加pBD2发现IκB-α/NF-κB变化不明显，TAK1/JNK显著下降，p38MAPK无显著变化，同时IL8表达下调。说明pBD2有一定的消炎作用，而TAK1/JNK可能在消炎过程中发挥作用。
　　(4)大肠杆菌侵染细胞2h后，pBD2表达量显著下降，加入外源性pBD2后，表达量显著升高。

目录

声明

致谢

摘要

常用词语英文缩写

1 文献综述

1．1 防御素的结构和功能

1．1．1 防御素的结构

1．1．2 β防御素的生物学活性

1．1．3 猪β防御素基因在组织中的分布

1．2 防御素的应用前景

1．3 TLRs受体的结构功能

1．4 NF-κB和MAPK信号通路

1．5 荧光定量和蛋白免疫印迹技术

1．5．1 荧光定量PCR(RTFQ-PCR)技术的应用

1．5．2 蛋白免疫印迹(Western Blot)技术的应用

1．6 研究的目的及意义

2 引言

3 材料与方法

3．1 试验材料

3．1．1 菌种禾口细胞

3．1．2 试剂耗材

3．1．3 主要试剂及配制

3．1．4 主要仪器与设备

3．2 试验方法

3．2．4 SDS-PAGE分析

3．2．5 重组蛋白活性分析

3．2．7 样本的采集和处理

3．2．8 总RNA的提取及cDNA合成

3．2．9 实时荧光定量PCR检测

3．2．10 细胞总蛋白抽提及蛋白免疫印迹检测

4 结果与分析

4．1 pBD2蛋白的诱导表达与纯化

4．2 pBD2蛋白对大肠杆菌ATCC 25922抑菌活性分析

4．3 大肠杆菌感染对IPEC-J2细胞的影响

4．3．2 大肠杆菌感染细胞对TLRs表达的影响

4．3．3 大肠杆菌感染对IPEC-J2细胞NF-κB和MAPK信号通路基因表达的影响

4．3．4 大肠杆菌感染对IPEC-J2细胞IL8、ZO-1、ZO-2基因表达的影响

4．3．5 大肠杆菌感染对IPEC-J2细胞内源性pBD2基因表达的影响

4．3．6 大肠杆菌感染对NF-κB p65蛋白表达的影响

4．4．1 pBD2对大肠杆菌感染细胞TLR4和信号通路基因表达的影响

4．4．2 pBD2对大肠杆菌感染IPEC-J2细胞IL8表达的影响

4．4．3 pBD2对大肠杆菌感染IPEC-J2细胞内源性pBD2表达的影响

5 讨论

5．1 pBD2体外对大肠杆菌活性的影响

5．2 大肠杆菌感染对IPEC-J2细胞形态的影响

5．4 pBD2对大肠杆菌侵染细胞TLRs及炎症反应的影响

5．5 pBD2影响炎症反应的分子机制

5．6 pBD2对大肠杆菌侵染细胞内源性pBD2表达的影响

6 结论

参考文献