禽4型腺病毒的分离鉴定及其华中地区分子流行病学调查

摘要

心包积液综合征(hydropericardium syndrome，HPS)是由禽4型腺病毒(Serotype4Fowl Adenovirus，FAdV-4)引起的病毒性传染病，由于首次爆发于巴基斯坦的安卡拉地区，因此也被称为安卡拉病毒。FAdV-4是一种无囊膜，双链DNA病毒，病毒粒子在70-90nm，属于腺病毒科，禽腺病毒属，禽腺病毒C种。FAdV-4主要感染3-5周龄的肉鸡、蛋鸡，临床症状主要表现为黄色或淡黄色的心包积液，而且大多数情况伴随有肝脏肿大。
　　2015年7月以来，FAdV-4在中国多个地区中小型肉鸡场、蛋鸡场屡屡爆发，给中国的家禽养殖业带来巨大损失。由于缺乏对中国流行的FAdV-4毒株的分子进化特征和致病性特征的了解，目前暂无有效的防控措施。本研究从河南爆发该病的12个地级市采样，并进行病毒的分离鉴定和分子流行病学调查，也对致病情况进行了初步研究，旨在为该病的防控提供新线索。
　　本研究从河南境内的安阳、鹤壁、濮阳、新乡、焦(竹)、郑州、开封、商丘、许(昌)、周口、平顶山、漯河采样，通过鸡胚绒毛尿囊膜途径分离病毒，PCR和测序的方法鉴定。最终分离到了地域来源不同的12个毒株，并鸡肝原代细胞(CEL)上稳定传代，为FAdV-4的进一步研究奠定基础。
　　本研究基于Hexon基因，对文分离的12个毒株和24个参考毒株构建进化树，结果表明:本次分离毒株属于禽4型腺病毒毒株，本次中国爆发的主要毒株与之前流行的毒株在遗传关系上较远，与印度的两个毒株PJ-06和PK-01亲缘关系较近。同时进行核酸和氨基酸对比分析，结果表明:与同一簇中的ON1、KR5、MX-SHP95、PK-01、PJ-06毒株相比较，本次毒株的Hexon基因的核苷酸差异率分别为1.31％、1.10％、1.42％、2.77％、2.84％。结合进化树和氨基酸分析，表明本次分离的12个毒株处于同一相对独立的分支，可能具有共同的来源，同时本次流行的毒株不是来源于本土毒株，而是来源于印度的毒株。
　　本研究基于Hexon蛋白基因，设计引物，构建标准质粒，建立了RT-PCR的定量检测方法。在标准质粒拷贝数在102-109范围内，CT值与拷贝数具有良好的线性关系，特异性和重复性良好。同时选择HNZZ分离毒株通过肌肉注射人工感染21日龄SPF雏鸡，对照组注射等剂量的无菌生理盐水。逐日观察记录鸡的精神状态、发病情况、饮食饮水情况和存活时间，死亡后采集心脏、肝脏等器官，观察各器官病理组织学变化。结果显示，感染组鸡只出现精神沉郁、食欲不振、嗜睡等症状，并在2-3天内全部死亡，解剖发现典型的病理变化:淡黄色的心包积液和肝脏肿大;而对照组精神正常，饮水饮食正常，没有死亡，解剖也没有发现明显症状和病理损伤。结果表明，分离的病毒具有较强的致病性，与本次流行毒株临床症状一致。

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论文说明

致谢

摘要

第一部分 文献综述

1 禽腺病毒的概况

2 禽腺病毒的分类

3 禽腺病毒的病毒粒子特征和分子生物学特点

3．1 禽腺病毒的形态结构和理化特性

3．2 禽腺病毒的基因组结构

3．3 主要蛋白和功能

3．4 病毒复制过程

3．5 腺病毒载体

4 禽腺病毒的检测方法

4．1 血清学诊断

4．2 病毒的分离鉴定

4．3 分子生物学检测技术

5 禽腺病毒流行病学

5．1 易感动物

5．2 临床症状

6．1 禽腺病毒油乳剂灭活苗的研制

6．2 禽腺病毒DNA疫苗的研制

7 研究的目的和意义

第二部分 研究内容

第1章 禽腺病毒的分离鉴定和增殖培养

1 材料

2 方法

3 结果与分析

4 讨论

第2章 禽4型腺病毒在华中地区的分子流行病学

1 材料

2 方法

3 结果分析

4 讨论

第3章 禽4型腺病毒的荧光定量检测方法和致病-性研究

1 材料

2 方法

3 结果分析

4 讨论

全文总结

参考文献