适用于PRRSV感染的全Cathepsin基因shRNA文库及稳定敲减Marc145细胞系的建立方法

摘要

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是动脉炎病毒科动脉炎病毒属的有囊膜单股正链RNA病毒，可以导致猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，造成仔猪和育成猪呼吸障碍、食欲不振、母猪流产、产死胎、木乃伊胎等。自1987年首次发现，PRRS已成为全世界养猪业的重要传染病之一，每年给养猪地区和国家带来巨大的经济损失。目前关于PRRSV的研究多集中于其病毒学特性、病毒起源、进化以及猪体对其产生的免疫应答等方面，关于PRRSV如何依赖宿主因子完成吸附、入侵、RNA脱壳、核酸蛋白质等生物大分子合成、子代病毒组装和释放生活周期的分子机制研究的尚不充分。
　　本研究以组织蛋白酶(cathepsin，CTS)为切入点，通过猴源cathepsin稳定敲减细胞系的构建，筛选出参与PRRSV生活周期的关键组织蛋白酶。首先，从NCBI数据库查找出非洲绿猴(Chlorocebus sabaeus)源全部的cathepsin基因共15种(cathepsin A、B、C、D、E、F、G、H、K、L、O、S、V、W、Z);根据RNAi原理设计shRNA引物，每种cathepsin分别设计三条针对不同靶点的shRNA;其次，将退火形成双链的shRNA连接至pLKO.1载体，得到45个pLKO.1-cathepsin shRNA载体;然后，将所构建载体包装成慢病毒，并以该慢病毒感染源于MA-104的非洲绿猴胚胎肾上皮细胞Marc145细胞系（对PRRSV易感），经嘌呤霉素(puromycin)筛选得到高效且稳定敲减cathepsin的Marc145细胞系;最后，用PRRSV-GFP毒株感染细胞系，检测cathepsin在PRRSV增殖过程中的作用。
　　结果显示，本研究成功构建了涉及15种cathepsin基因，共计45个pLKO.1-cathepsin-shRNA的质粒文库，并筛选出了稳定敲减cathepsin基因的细胞系。部分cathepsin的敲减对PRRSV的增殖具有抑制作用，但由于其它有作用的cathepsin的分子机制正在进一步研究，所以本文只选取了CTS L为代表显示cathepsin敲减对PRRSV的抑制作用。本研究成功建立了一种构建shRNA基因文库及相应敲减细胞系的方法，为进一步研究cathepsin在PRRSV生活周期中发挥的重要功能奠定了基础。

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致谢

摘要

英文缩略表

1 文献综述

1．1 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)

1．1．1 PRRSV的发现

1．1．2 PRRSV的主要特性

1．1．3 PRRSV的基因组编码的蛋白及功能

1．1．4 PRRSV的受体及功能

1．2 组织蛋白酶(cathepsin，CTS)

1．2．1 CTS及其主要特性

1．2．2 CTS的结构和定位

1．2．3 CTS的生理功能

1．2．4 CTS与疾病的发生

1．2．5 CTS与病毒感染

1．3 RNA干扰技术(RNA interference，RNAi)

1．3．1 RNAi的原理

1．3．2 RNAi的应用

1．4 展望

2 引言

3 材料与方法

3．1 实验材料

3．1．1 细胞和细胞培养

3．1．2 感受态与质粒

3．1．3 主要试剂

3．1．4 主要仪器

3．1．5 试剂配制

3．2 实验方法

3．2．2 猴源cathepsin基因shRNA重组质粒的构建和鉴定

3．2．3 质粒的提取

3．2．4 慢病毒颗粒包装

3．2．6 RNA的提取

3．2．7 RNA的反转录

3．2．8 荧光实时定量PCR检测

3．2．9 PRRSV-GFP感染cathepsin shRNA-Marc145细胞株

3．2．10 统计学处理

4 结果与分析

4．1 猴源cathepsin基因的shRNA靶序列

4．2 猴源cathepsin基因shRNA重组质粒构建及鉴定

4．3 cathepsin基因敲减效率

4．4 cathepsin L shRNA-Marc145细胞抑制PRRSV-GFP复制

5 讨论与结论

5．1 讨论

5．2 结论

参考文献