花生维生素E含量近红外模型构建及生育酚甲基转移酶基因(γ-TMT)序列分析

摘要

花生是我国主要的经济作物，富含蛋白和油脂等多种营养成分。维生素E抗氧化，可保护机体细胞免受自由基毒害。提高花生维生素E含量对于增进人体健康、延长食品及食用油货架期具有重要意义。维生素E含量测定长期以来依赖于液相色谱等技术，由于缺乏成本低廉、速度快、稳定可靠的选择鉴定技术，花生高维生素E育种迄今进展缓慢。近红外技术已应用于多个作物的品质改良，在花生上已成功建立了能准确预测油酸、脂肪、蛋白含量的近红外模型，但花生维生素E含量近红外模型迄今未见报道。生育酚甲基转移酶(γ-TMT)是生育酚生物合成过程中的关键酶，决定着α-生育酚相对含量。花生栽培种为异源四倍体，对应两个亚基因组应有两个γ-TMT基因，但目前仅从中获得1个γ-TMT基因。本研究的目的在于构建花生维生素E近红外模型，为花生高维生素E育种提供选择手段;克隆花生栽培种两个亚基因组γ-TMT基因，并分析其编码区序列差异与α-生育酚含量的关系，为通过分子育种手段培育高α-生育酚花生品种创造条件。
　　主要研究结果如下:
　　1、采用反相高效液相色谱法(RF-HPLC)对48份花生材料子仁中的维生素E含量进行了测定。结果表明，总维生素E含量变幅为8.2124～17.066mg/100g，平均值10.985mg/100g;α-生育酚含量变变幅为4.121～7.383mg/100g，平均值5.487mg/100g;γ-生育酚含量变幅为1.545～9.375mg/100g，平均值4.87mg/100g;δ-生育酚含量变幅为0.262～1.2mg/100g，平均值0.627mg/100g。α-生育酚与γ-生育酚相对含量呈极显著负相关(r=-0.99)。
　　2、采集了48份自然风干花生多粒和单粒种子近红外光谱，结合其后的RF-HPLC法维生素E含量测定结果，采用交叉检验，分别构建了多粒自然风干花生种子样品维生素E总量和α-生育酚含量的近红外定量分析模型以及单粒自然风干花生种子样品α-生育酚含量的近红外定量分析模型。经优化，多粒维生素E总量的最佳光谱预处理方法为“一阶导数+多元散射矫正”，谱区范围为7506～6094.3cm-1（厘米波数）、5454～4242.8cm-1，维数为8，模型的决定系数(R2)为88.34，根均方差(RMSECV)为0.423;多粒α-生育酚含量的最佳光谱预处理方法为“一阶导数+矢量归一化”，谱区范围为7506～4242.8cm-1，维数为10，模型R2为90.05，RMSECV为0.203;单粒α-生育酚含量的最佳光谱预处理方法为“一阶导数+MSC”，谱区范围为7506～4242.8cm-1，维数为8，模型R2为82.87，RMSECV为0.28。
　　3、从花生栽培种A、B两个亚基因组中成功克隆出2个生育酚甲基转移酶基因(γ-TMT)，分别命名为Ahγ-TMT和Ahγ-TMT2。生物信息学分析表明，Ahγ-TMT1编码区全长为3111bp，Ahγ-TMT2编码区全长为3124bp，都含有6个外显子和5个内含子，开放阅读框(ORF)长均为1059bp，编码352个氨基酸。基于γ-TMT氨基酸序列构建的系统进化树表明，花生与同为豆科的大豆和日本百脉根亲缘关系最近。
　　4、根据花生维生素E含量测定结果，选取24份代表性材料克隆γ-TMT基因，并分析编码区核苷酸序列和氨基酸序列变化。材料间Ahγ-TMT2编码区核苷酸序列无差异，Ahγ-TMT1编码区核苷酸序列有3处差异造成了氨基酸的改变，但相关性分析表明维生素E总量和各异构体含量无关。至于是否像其他作物中γ-TMT基因启动子区域变异导致了α-生育酚含量的提高，尚待进一步研究。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1．1 维生素E的化学组成和理化性质

1．1．2 维生素E的功能

1．1．3 维生素E的生物合成途径

1．1．4 维生素E合成途径的关键酶

1．2 花生中维生素E的研究进展

1．2．1 我国主产区花生中维生素E的分布

1．2．2 花生维生素E的检测技术

1．3 近红外技术和分子标记在花生上的应用

1．3．1 花生近红外定量分析模型构建

1．3．2 花生上应用的DNA分子标记

1．4 本研究的目的意义

第二章 高效液相色谱法测定花生中维生素E的含量

2．1 试验材料和方法

2．1．1 花生材料

2．1．2 化学试剂

2．1．3 仪器和设备

2．1．4 色谱柱规格

2．2 试验方法

2．2．1 维生素E异构体标准曲线的构建

2．2．2 花生维生素E含量的化学测定

2．3 结果与分析

2．3．1 维生素E各异构体的色谱图

2．3．2 花生中维生素E含量测定结果与分析

2．4 结论与讨论

第三章 花生维生素E近红外模型构建

3．1．1 材料

3．1．2 方法

3．2 结果与分析

3．2．1 花生仁中维生素E总量和α-生育酚的近红外多粒模型

3．2．2 花生仁中α-生育酚的近红外单粒模型

3．3 结论与讨论

第四章 花生γ-TMT基因的克隆和序列分析

4．1．5 主要试剂的配制

4．2 试验方法

4．2．1 基因编码区全长的获取

4．2．2 花生子仁DNA提取

4．2．3 花生γ-TMT基因的克隆

4．3 结果与分析

4．3．1 花生γ-TMT编码区序列的克隆

4．3．2 花生γ-TMT的生物信息学分析

4．4 结论与讨论

第五章 不同花生材料γ-TMT基因序列差异及其与维生素E含量的关系

5．1 材料与方法

5．1．1 试验材料

5．1．1 试剂、耗材、仪器

5．1．2 实验方法

5．2 结果与分析

5．2．1 花生γ-TMT编码区序列的克隆

5．2．2 不同花生材料γ-TMT基因序列差异及其与维生素E含量的关系

5．3 结论与讨论

参考文献

致谢

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