河南省杨树溃疡病病原菌鉴定及生物学特性研究

摘要

杨树溃疡病是杨树上危害最严重的病害之一，杨树苗木、幼树、大树均可受该病侵害，以苗木、幼树受害最重，河南省近年来杨树溃疡病发病非常严重，已成为阻碍杨树产业发展的主要因素之一。关于杨树溃疡病病原各地报道不尽一致，现已报道的有十几种。由于杨树溃疡病菌及其相关植物病原菌的形态（特别是无性阶段的形态）差异不够明显，仅靠病原菌形态对杨树溃疡病做出准确的病原鉴定是很困难的。关于河南省杨树溃疡病的病原菌尚无系统的研究报道。
　　本研究从河南省18个地市采集杨树溃疡病标样，通过分离培养，以形态和DNA序列（ITS和β-tubulin序列）进行病原种类鉴定，以查明河南省杨树溃疡病菌的种类与菌株构成，并研究了河南省杨树溃疡病菌的生物学特性，以期为河南省杨树溃疡病的监测与控制提供依据。主要研究结果如下：
　　1.分离获得了18个杨树溃疡病菌株，经在杨树枝条上进行回接试验，均能产生典型的溃疡病症状，根据菌落特征可将这些菌株分为3个类群。培养中仅出现了无性世代，形态特征基本一致，与文献上描述的聚生小穴壳(Dothiorella gregariaSacc.)和七叶树壳梭孢（Fusicoccum aesculiCorda.）的形态比较近似。
　　2.试验中分别测得了18个菌株的ITS和β-tubulin基因序列，与NCBI登录的序列比对后得出，这些菌株均为葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea(Moug:Fr) Ces. et de Not.，结合形态特征和文献资料，确定河南省杨树溃疡病菌的无性型为七叶树壳梭孢（F. aesculi）。
　　3.基于测得的18个菌株的ITS和β-tubulin基因序列，应用邻位相连法(NJ)和最大简约法(MP)建立系统发育树，分析了菌株之间的亲缘关系，发现这些菌株可以分为若干个亚群。
　　4.对河南省杨树溃疡病菌的生物学特性研究表明，该菌菌丝生长的最适温度是25℃；在供试碳源中，以蔗糖最好，氮源以蛋白胨最好；该菌对 pH适应性较强，pH值2~11均可生长，最适pH值为6；在供试的16种杀菌剂中，杨树溃疡病菌对80％乙蒜素EC、430g/L戊唑醇SC、15%噻枯唑WP最为敏感。
　　综合以上研究，根据 DNA序列分析，可以确定河南省杨树溃疡病菌有性型名称为葡萄座腔菌(B. dothidea)，无性世代名称为七叶树壳梭孢（F. aesculi）。80%乙蒜素EC、430g/L戊唑醇SC、15%噻枯唑WP可作为防治杨树溃疡病的试验用药剂。

目录

第1章 前言

1.1杨树溃疡病研究现状

1.1.1杨树溃疡病的发生危害情况

1.1.2发病规律

1.1.3病原菌

1.1.4病原菌的生物学特性

1.1.5溃疡病对杨树生长的影响和防治指标

1.1.6杨树对溃疡病的抗性表现与机制

1.1.7杨树溃疡病的防治

1.2植物病原真菌的分子鉴定方法

1.2.1基于rDNA内转录间隔区（ITS）序列的病原真菌分子鉴定

1.2.2随机扩增多态性DNA（RAPD）

1.2.3限制性酶切片段长度多态性（RFLP）技术

1.2.4其他分子系统学研究方法

1.2.5杨树溃疡病菌的分子系统学研究

1.3本研究的目的

第2章 杨树溃疡病菌的分离、致病性测定和形态鉴定

2.1材料与方法

2.1.1标样采集和分离

2.1.2菌株的致病性测定

2.1.3病原菌菌落与菌丝特征

2.2结果与分析

2.2.1发病症状

2.2.2分离结果

2.2.3致病性测定结果

2.2.4形态观察结果

第3章 杨树溃疡病菌的分子鉴定

3.1试验材料

3.1.1供试菌株

3.1.2试剂

3.1.3 PCR引物序列

3.1.4试验仪器

3.2试验方法

3.2.1基因组DNA提取和质量检测

3.2.2 PCR扩增

3.3结果与分析

3.3.1 ITS测序及分析

3.3.2β-tubulin基因测序及分析

第4章 杨树溃疡病菌的生物学特性研究

4.1试验材料及方法

4.1.1试验材料

4.1.2温度对菌丝生长的影响

4.1.3培养基种类对菌丝生长及子实体产生情况的影响

4.1.4碳源对菌丝生长及子实体产生情况的影响

4.1.5氮源对菌丝生长及子实体产生情况的影响

4.1.6 pH对菌丝生长及子实体产生情况的影响

4.1.7杨树溃疡病菌对不同杀菌剂的敏感性测定

4.2结果与分析

4.2.1温度对菌丝生长的影响

4.2.2培养基对菌丝生长及子实体产生的影响

4.2.3碳源对菌丝生长及子实体产生的影响

4.2.4氮源对菌丝生长及子实体产生的影响

4.2.5 pH对菌丝生长及子实体产生的影响

4.2.6杨树溃疡病菌对不同杀菌剂的敏感性

第5章 结论与讨论

参考文献

附图

致谢

攻读硕士学位期间的研究成果