tap基因在果蝇神经系统发育中的功能与调控机制研究

摘要

目的：果蝇tap基因编码进化保守的碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）蛋白，本研究初步探索其在果蝇神经系统发育过程中的功能和调控机制。
　　方法：基于NCBI数据库中果蝇Tap蛋白的氨基酸序列，采用生物信息学技术从Tap蛋白的理化特征、跨膜区域、信号肽、结构域、三维结构和物种间同源蛋白进化关系等方面对Tap蛋白的结构和功能进行分析。构建pUAS-tap重组质粒，运用显微注射技术和mini-white基因筛选，获得UAS-tap转基因果蝇，并将转基因品系分别和ap-GAL4品系、GMR-GAL4品系杂交，采用定量RT-PCR方法检测杂交前后tap基因表达水平，并在显微镜下观察杂交后代的发育情况。按照Trizol法提取野生型果蝇、tap基因突变体果蝇胚胎期总RNA，采用琼脂糖凝胶电泳、NanoDrop、生物分析仪2100系统检测总RNA的质量。制备好的RNA测序文库，采用HiSeq2500平台、单端SE50策略进行高通量测序。测序所得的原始数据经去接头、去低质量序列处理后得到高质量干净序列进行后续生物信息学分析，包括参考基因组比对分析、基因表达水平定量、差异表达基因DEGs分析、GO/KEGG富集分析，利用实时定量PCR方法验证部分DEGs。
　　结果：生物信息学的分析结果发现Tap蛋白属于不稳定的亲水蛋白，没有跨膜区及信号肽，位于细胞核发挥作用，具有一个碱性螺旋-环-螺旋结构域。Tap蛋白与来源于NeuroD1的模板2ql2.1.B有61.02％的氨基酸序列一致，Tap蛋白与人类和啮齿动物的同源蛋白高度同源，在系统发育树中距离最近。成功构建了pUAS-tap重组质粒，通过显微注射与转基因果蝇筛选、平衡及定位，共获得5个独立的转基因品系。tap基因靶向表达后引起成虫出现糙眼，翅膀出现异位刚毛和异位翅脉表型。RNA-Seq结果发现，野生型和tap基因突变体果蝇样品之间共有6064个DEGs，其中上调基因2720个，下调基因3344个。GO功能富集分析发现DEGs主要参与细胞过程、有机物代谢过程、蛋白质转运、蛋白质定位等生物学过程，发挥的分子功能集中在蛋白质结合和核苷酸结合。KEGG代谢通路富集分析发现DEGs显著富集的Pathway有剪接体、内质网蛋白质加工、Notch信号通路、背腹轴形成等。实时定量PCR验证结果发现20个随机选择基因的表达趋势与RNA-Seq结果一致。
　　结论：果蝇 Tap蛋白具有 bHLH蛋白家族的典型结构，tap基因通过 Notch信号通路介导的原神经模式，或者调节神经前体细胞分化而参与胚胎早期神经发育过程。RNA-Seq分析结果为tap基因分子机制的深入研究和互作基因的筛选奠定了基础。对该基因功能与调控的深入研究，将与脊椎动物中其同源基因ngn的同类研究互相借鉴。

目录

声明

第1章 原神经基因在神经系统发育中的功能研究进展

1.1 原神经基因的发现和家族成员

1.2 原神经基因作用模式

1.3 侧向抑制

1.4 原神经基因在果蝇神经系统发育中的功能

1.5 原神经基因在脊椎动物神经系统发育中的功能

1.6 结论与展望

第2章 前言

第3章 材料与方法

3.1 实验材料

3.2 实验方法

第4章 结果

4.1 果蝇Tap蛋白结构与功能的生物信息学分析

4.2 UAS-tap转基因果蝇品系构建及异常表达表型观察

4.3 tap基因突变体转基因果蝇品系RNA-Seq结果

第5章 讨论

5.1 果蝇Tap蛋白结构与功能的生物信息学分析

5.2 UAS-tap转基因果蝇品系构建及异常表达表型的观察

5.3 tap基因突变体转基因果蝇品系RNA-Seq分析

5.4 问题与展望

第6章 结论

参考文献

缩略语词汇表

附录I 补充材料

致谢

攻读学位期间的研究成果