二维电泳和质谱技术鉴定食管鳞癌N-连接糖蛋白差异表达谱

摘要

背景:EC(Esophageal Cancer, EC)是世界上八大常见的恶性肿瘤之一。在中国,EC的主要组织学类型为食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma, ESCC),约占所有EC的90％。河南太行山区的林州市及其毗邻的辉县、安阳等地区是世界及我国EC发病率和死亡率最高的地区之一,目前仍是该地区肿瘤相关死亡的主要原因之一。EC的重要特征之一是高死亡率,大多数病人在临床上确诊之后的生存时间不超过一年,其五年生存率仅为8%。提高EC治疗效果的关键在于早期发现、早期诊断和早期治疗,食管原位癌和粘膜内癌患者的术后五年生存率可分别达到100%和95%。然而,目前尚无早期诊断和预警的有效措施。因此,阐明ESCC的发病因素及多阶段演进分子机制,筛选和鉴定与癌变密切相关的预警分子,找寻新的治疗靶点和更有效治疗方法,对建立高危人群监测和ESCC早期诊断的生物标志物和方法,从而降低其发病率和死亡率,具有十分重要的理论意义和临床应用价值。
　　定量蛋白质组学是后基因组时代研究热点之一,是疾病诊断的分子标志物筛选和治疗靶点鉴定的重要工具。二维电泳和稳定同位素标记蛋白或肽段是定量蛋白质组学常用的两种技术。然而,由于蛋白质组分极其复杂,不但包括同一基因的不同转录体、转录后不同的剪切体,还涉及翻译后的修饰过程。到目前为止,没有任何单一技术能够彻底全面的分析任意物种的全部蛋白质组组分,而且高丰度蛋白通常掩盖了具有重要生理、病理功能的低丰度蛋白。亚蛋白质组学能够有效降低蛋白质组的复杂性,是挖掘低丰度蛋白生物标志物常用策略之一,如细胞膜、线粒体、细胞核等亚蛋白质组、各功能复合体蛋白质组、特异物理化学结构的蛋白质组等。
　　哺乳动物中,蛋白质糖基化修饰是最为常见的一种翻译后修饰,糖蛋白约占所有蛋白的50%。糖蛋白的寡糖侧链不但具有重要的生理功能,如蛋白质分子细胞内定位、蛋白稳定性、酶活性、粘附性、蛋白质分子间及细胞间相互作用、识别等功能;而且亦参与许多病理过程,如蛋白质的异常糖基化是肿瘤形成与进展过程中的一个基本特性,与癌细胞的侵袭、转移过程密切相关。糖蛋白的功能日益显著和重要,详尽阐明糖蛋白质组组分及功能有助于增进理解认识生理、病理过程。
　　根据寡糖侧链共价结合的氨基酸残基不同,可将糖蛋白分为N-连接糖蛋白(与天冬酰胺残基酰胺氮相连)和O-连接糖蛋白(与丝氨酸、苏氨酸或羟赖氨酸残基的羟基共价结合)。N-糖基化位点是N-X-S/T组成的三联序列子区域,其中的X可为脯氨酸以外的任意氨基酸。N-寡聚糖侧链的变异发生于多种肿瘤,包括寡聚糖核心结构及末端残基结构的变化;该变异同时也导致同一蛋白形成不同糖蛋白异构体,在二维凝胶电泳图谱上表现为多个不同等电点或分子量相近的蛋白质点。寡聚糖作为蛋白质分子翻译后修饰的主要成分之一,大大增加了蛋白质分子的功能多样性。在细胞外的微环境中,N-连接糖蛋白存在相当普遍,如胞膜蛋白的胞外区域、分泌蛋白及血清、唾液、脑脊液等体液内。上述证据表明糖蛋白变化反映了许多疾病的病理过程,具有重要的临床应用价值,故而许多现在临床应用的诊断标志物或治疗靶点多为糖蛋白,如CA125(卵巢癌)、PSA(前列腺癌)、c-erbB-2(乳腺癌)、AFP-L3和GP73(肝癌)等。可以预见,系统、定量分析糖蛋白的变化,不但有利于新的疾病诊断标志物、治疗靶点及治疗效果的评价与监测手段的探寻,还有助于进一步理解疾病发生发展的规律及治疗的分子机制。
　　方法：采用植物凝集素串联法提取ESCC与癌旁切缘形态学正常食管黏膜组织中的N-连接糖蛋白,二维电泳和质谱等分析、鉴定与ESCC发生展密切相关的差异表达的糖蛋白质分子,为ESCC的早期诊断和高危人群普查提供更多的候选分子,并为深入理解ESCC发病的分子机制奠定重要理论基础。
　　1、根据标本库中ESCC患者的临床资料,如年龄、性别、病理分化程度、浸润深度、淋巴结转移、TNM分期等,选取适宜手术标本,NP-40裂解液提取各例ESCC及癌旁组织蛋白,Bradford法测定蛋白浓度,从各例ESCC标本及癌旁组织蛋白提取物中,分别取等量蛋白制备混合样本。
　　2、植物凝集素亲合层析柱的制备:寡甘露糖型亲合层析柱,分别加入500ul的琼脂糖偶联刀豆凝集素(Concanavalin A, ConA)、晶状体凝集素(Lentil lectin, LCH)、雪花凝集素(Sonwdrop lectin, GNA)于Poly-Prep层析柱内;唾液酸型蛋白层析柱,分别加入等量的琼脂糖偶联的麦胚凝集素(Wheat germ agglutinin, WGA)、接骨木凝集素(Elderberry lectin, SNA)于Poly-Prep层析柱内;然后用含有0.01%Triton X-100的糖蛋白结合缓冲液洗涤1次,再用糖蛋白结合缓冲液洗涤2次以备用。
　　3、N-连接糖蛋白序列性抽提:用N-连接糖蛋白结合缓冲液将6000ug的混合蛋白标本稀释至1ml,加入寡甘露糖蛋白亲合层析柱,室温孵育2h,500rpm收集流出液,结合缓冲液洗涤4次,各10min,用200mM的甲基-α-D甘露糖苷洗脱富含寡甘露糖的N-连接糖蛋白;混合上述的流出液及洗涤液,加入唾液酸蛋白层析柱,如上洗涤后用200mM的N-乙酰葡糖胺洗脱富含唾液酸的N-连接糖蛋白。
　　4、二维电泳及质谱技术鉴定差异表达的糖蛋白质分子:将上述洗脱液中加入-20℃丙酮使终浓度至80%,-20℃过夜,15,000g离心30min,弃上清,室温干燥20min,加入100ul的2D裂解液溶解沉淀蛋白。Bradford法测定蛋白浓度,取50μg的蛋白,加入2D裂解液至250ul,用13cm pH3-10 NL IPG胶条进行一维等电聚焦电泳;等电聚焦后分别用含1%DTT和2.5%IAA平衡液孵育15min,然后进行第二维的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染、扫描、图像分析、统计学分析,确定具有显著统计学意义的差异蛋白点。制备质谱分析的2D胶,蛋白的上样量增加至1000ug,如上法进行等电聚焦、二维电泳、考马斯亮蓝染色,切取差异表达的蛋白质点、胶内胰酶消化、MALDI-TOF-TOF检测、数据库检索确定差异蛋白点的名称。
　　5、关键候选糖蛋白质分子差异表达的验证:应用Western blot,验证关键候选蛋白质分子或具有异常N-连接糖基化的蛋白质异构化在ESCC中的差异表达。
　　结果:
　　1、鉴定出36个ESCC相关的差异表达的寡甘露糖型糖蛋白,包括20个高表达寡甘露糖型糖蛋白和16个低表达寡甘露糖型糖蛋白;
　　2、鉴定出39个与ESCC相关的差异表达的唾液酸型糖蛋白,包括10个高表达唾液酸型糖蛋白和29个低表达糖蛋白;
　　3、Westen blot验证结果表明:与切缘癌旁正常食管黏膜相比,HP和Clusterin在ESCC中表达明显降低,而C3在ESCC中的表达增高。
　　结论
　　1、本研究系统全面的鉴定了与ESCC发生发展相关的N-连接糖蛋白差异表达谱;
　　2、本研究鉴定的差异表达的N-连接糖蛋白为ESCC高危人群筛查、早期诊断的生物标志物寻找提供了更多的候选分子,并为进一步理解ESCC发生发展的分子机制奠定了重要理论基础。

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正文

1.1 前 言

1.2 材料、试剂与仪器

1.2.1 ESCC组织及ESCC边缘组织

1.2.2 主要试剂及配制

1.2.3 主要仪器

1.3 方 法

1.3.1 ESCC组织TNM分期

1.3.2 IP裂解液提取ESCC蛋白

1.3.3 Bradford法法测定各组织总蛋白浓度

1.3.4糖蛋白质抽提

1.3.5 蛋白质二维凝胶电泳

1.3.6 质谱技术定性分析

1.3.7 Western blot 蛋白凝胶电泳

1.4 实验结果

1.4.1 寡甘露糖型糖蛋白差异蛋白表达点

1.4.2唾液酸型糖蛋白差异蛋白表达点

1.4.3差异表达蛋白点的质谱鉴定

1.4.4Westen blot 验证结果

1.5讨 论

结论

参考文献

文献综述

参考文献

致谢

附录

在读期间发表的学术论文与研究成果