桂花SSR引物的开发和SCoT分子标记体系的建立

摘要

桂花（Osmanthus fragransLour.），隶属于木犀科（Oleaceae）木犀属（Osmanthus），是我国传统十大名花之一。我国是木犀属植物的分布中心，拥有木犀属和桂花品种国际登录权威，但桂花育种多年来一直进展缓慢。杂交育种是培育优良品种的有效途径之一，然而，桂花从种子萌发到开花需要6-8年的时间，育种周期很长。利用合适的分子标记构建高密度的分子遗传图谱可以鉴定出与表型变异密切相关的标记位点。这些标记可以用于早期育种时的早期选择，有效提高桂花育种的效率，节约成本。SSR（Simple Sequence Repeat，简单重复序列）标记是基于DNA长度多态性的分子标记技术，该技术检测手段简易且特异性强，成为分析群体遗传结构及构建分子遗传图谱的重要工具。SCoT（start codon targeted polymorphism，目标起始密码子多态性）是以植物基因组中ATG位点侧端的保守性来设计引物（单引物），产生与目标基因相关联的多态性标记，其操作简便、可靠性高，目前已成功运用于水稻等多种植物中，是传统的分子标记 AFLP、RAPD、SRAP和ISSR等的重要技术补充。
　　本研究主要内容包括：⑴采用高通量测序法开发了桂花的 SSR引物。共获得89633条序列片段，利用MISA1.0搜索具有重复单元的序列，primer5.0进行引物设计，最终获得3006条SSR引物，已向GenBank提交1471条。⑵目前随机筛选了其中的100对，80对不能检测到条带或不具有多态性，20对具有多态性，且扩增条带清晰。因此有大量的SSR引物可用于构建桂花的饱和分子遗传图谱。⑶以2×Es TaqMasterMix预混液为基本体系，针对影响桂花SCoT扩增反应的退火温度、模板用量、引物浓度等因素进行优化，建立了适于桂花SCoT分子标记的体系。从36对SCoT引物中筛选出了可用于桂花的12条SCoT引物。12μL反应体系含有30 ng模板DNA，引物浓度为0.4μmol.L-1。不同的引物退火温度分别为48℃、49.9℃、54.3℃或56℃。⑷运用该体系对12个桂花品种进行扩增，共得到了244条带，其中多态性条带占238条，多态性比率高达97.47％，每对引物平均扩增出的多态性条带数是19.83条。对SCoT扩增的结果采用UPGMA法进行聚类分析，表明桂花各品种之间的亲缘关系与花色不完全相关，这与其它分子标记的结果相类似。实验结果表明，本研究建立的SCoT分子标记体系结果稳定，可用于桂花分子遗传图谱的构建。

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1 前言

1.1 桂花品种的遗传多样性及分析方法

1.1.1形态学分类研究

1.1.2细胞学研究

1.1.3生理生化研究

1.1.4 分子水平研究

1.2常用的分子标记技术

1.2.1 RFLP的原理及特点

1.2.2 RAPD的原理及特点

1.2.3 AFLP的原理及特点

1.2.4 SRAP的原理及特点

1.2.5 SSR的原理及特点

1.2.6 ISSR的原理及特点

1.2.7 SCoT的原理及特点

1.3常用分子标记技术在桂花中的应用

1.3.1 RAPD标记的应用

1.3.2 AFLP标记的应用

1.3.3 SRAP标记的应用

1.3.4 SSR标记的应用

1.3.5 ISSR标记的应用

1.4本研究的目的及意义

2 桂花SSR分子标记的开发

2.1 实验材料

2.2 试验方法

2.2.1 桂花基因组DNA 的提取

2.2.2文库构建

2.2.3测序反应

2.2.4引物设计

2.2.5优化与检测引物

2.3结果分析

2.3.1桂花基因组DNA的提取

2.3.2 454测序结果

2.3.3桂花SSR分子标记引物检测分析

2.4讨论

2.4.1 DNA模板质量

2.4.2文库的制备

2.4.3桂花高密度分子遗传图谱的构建

3 桂花SCoT引物的筛选及分析

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.2.1 桂花基因组DNA 的提取

3.2.2 SCoT-PCR扩增及退火温度的筛选

3.2.3 DNA模板和引物浓度的筛选

3.2.4 筛选引物对12个桂花品种的扩增

3.2.5非变性PAGE电泳非变性PAGE的配置

3.2.6数据统计与处理

3.3 结果与分析

3.3.1 桂花基因组DNA的提取

3.3.2 退火温度的确定

3.3.3 DNA模板用量和引物浓度的确定

3.3.4 12个桂花品种的SCoT分析

3.3.5桂花品种间的遗传多样性分析

3.4讨论

3.4.1 DNA模板质量

3.4.2引物设计

3.4.3预混体系2×Es TaqMasterMix的控制

3.4.4 PCR反应的控制

3.4.5 非变性PAGE的控制

3.4.6桂花遗传多样性的探讨

4结论

参考文献

致谢