三七总皂苷对B16细胞缝隙连接功能的影响及其对B16黑色素瘤转移的抑制作用

摘要

研究目的：观察三七总皂苷(panax notoginseng saponins, PNS)对B16黑色素瘤转移的作用。同时进一步探明这种作用与其影响 B16细胞缝隙连接细胞间通讯(gap junction intercellular communication, GJIC)及缝隙连接蛋白32（Connexin32，Cx32）表达的关系和内在机制。
　　实验方法：1.建立B16黑色素瘤自发性肺转移模型 C57BL/6小鼠60只，于小鼠左后肢爪垫皮下注射 B16黑色素瘤细胞悬液50ul（1×107·ml-1）。建立模型24小时后，随机分成生理盐水组（NS，0.2 mL·10g-1），PNS（120mg·kg-1）、PNS（240mg·kg-1）、PNS（480mg·kg-1）三个剂量组，每组12只。每日灌胃给药，给药体积为0.2 mL·10g-1。（1）接种瘤液后第23天，用0.5％戊巴比妥钠麻醉小鼠，结扎股动脉，截除荷瘤下肢，称重，计算抑瘤率。（2）切除原发灶后继续给药三周，于模型建立后第46天处死小鼠，取下小鼠肺脏，观察肺脏肿瘤转移情况，对肺转移灶进行计数。（3）免疫组化检测Cx32在黑色素瘤原发灶的表达情况，观察PNS对黑色素瘤原发灶中Cx32表达的影响。2.采用划痕标记/染料示踪技术（SL/DT），观察不同浓度 PNS作用 B16细胞，其 GJIC功能的变化。用分子量为457.2D的荧光黄染料(Lucifer Yellow, LY)标记损伤细胞，通过LY染料在细胞间的传递情况来反映细胞间的缝隙连接通讯功能。3.免疫印迹（Western blot）检测Cx32在各组B16细胞中的表达情况。4.通过细胞-基质粘附实验，观察PNS对B16细胞与基质胶（Matrigel）的粘附能力的影响
　　实验结果：1.成功建立B16黑色素瘤自发性肺转移模型小鼠于接种肿瘤细胞后8~12天在接种部位形成黑素沉着斑，之后逐渐增大，突起，形成肿瘤结节。于接种瘤液后第23天切除肿瘤，见肿瘤质地较软，黑色，包膜基本完整部分有坏死或溃疡。HE染色病理组织学检查：瘤组织排列结构复杂，呈巢状、或弥散分布。细胞体积大，多边形，核呈空泡状，核仁明显，部分可见核分裂像，肿瘤细胞内含有黑色素颗粒，提示B16-BL6小鼠黑色素瘤自发性转移模型复制成功。2. PNS对原发位黑色素瘤生长的影响 PNS（240mg·kg-1、480mg·kg-1）两个剂量组，与对照组瘤重相比较具有显著性差异，肿瘤抑制率分别达到32.09%和50.85%。3. PNS对黑色素瘤肺转移的影响通过对小鼠肺转移灶计数和评分结果进行统计分析后发现，与模型组相比PNS240mg·kg-1、480mg·kg-1两个剂量组能有效抑制黑色素瘤的肺转移，转移灶数量和大小与对照组相比有明显地减少和缩小。4. PNS对黑色素瘤细胞膜上Cx32的表达的影响免疫组织化学检测并对染色结果进行分级，经分析后得到的结果显示：PNS各用药组中的黑色素瘤原发灶肿瘤细胞膜上Cx32的表达均得到了增强。5. PNS对B16细胞的缝隙连接通讯功能的作用采用划痕标记/染料示踪技术（SL/DT）在荧光显微镜下进行观察，发现不同剂量的PNS（100μg·ml-1、200μg·ml-1、400μg·ml-1）在不同程度上提高了B16细胞间的GJIC功能。随PNS浓度增高，LY染料传输范围逐渐增大，最远可达划痕旁3～4层细胞。6. PNS对B16细胞中Cx32的表达量的影响 Western blot的检测结果显示PNS各剂量组与对照组比较Cx32的表达量无明显变化。7. PNS对B16细胞与基质的粘附能力的影响通过细胞-基质粘附实验结果计算肿瘤细胞的相对粘附率，结果显示PNS能够抑制 B16细胞的基质粘附能力。同时发现GJ功能增强剂维甲酸钠（all trans-retinoic acid,RA）同样具有抑制 B16细胞与基质粘附能力的作用，表明GJ功能的上调和恢复能够影响肿瘤细胞的基质粘附能力。PNS对B16细胞的基质粘附能力的抑制作用可能与其上调肿瘤细胞间的GJ功能有关。
　　实验结论：
　　1. PNS能够抑制B16黑色素瘤的生长和转移。
　　2. PNS能够增强肿瘤细胞膜上Cx32的表达，上调和恢复B16细胞的GJ功能，但并不影响Cx32在肿瘤细胞中的表达量。
　　3. PNS能够抑制 B16细胞的基质粘附能力，抑制肿瘤转移，这一作用可能与其上调GJIC功能存在密切关系。

目录

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中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

1. 实验材料

2.实验方法

实验结果

1．肿瘤形成特性及病理组织学观察

2． PNS对黑色素瘤生长的抑制作用

3. PNS对B16黑色素瘤肺转移的影响

3. 各组Connexin32在肿瘤原发灶的表达情况

4. PNS对B16细胞GJIC功能的影响

5. PNS对B16细胞CX32蛋白表达的影响

6. PNS对B16细胞基质粘附能力的影响

讨论

结论

参考文献

致谢

附 录 A英 文 缩 略 词 表

附 录B在校期间已发表的文章

附 录C 综述:缝隙连接在肿瘤转移中的研究进展