丁苯酞对血管性痴呆小鼠胆碱乙酰转移酶代谢影响机制的研究

摘要

目的：血管性痴呆(vascular dementia，VD)由于各种脑血管病引起的获得性认知功能障碍，以学习、记忆功能缺损为主要症状。随着社会人口的日益老龄化和脑卒中治愈率的不断提高，VD的发病呈迅速增长趋势，成为严重危害老年人身心健康的常见疾病，给社会和家庭带来沉重的负担。目前VD的发病机制尚未明确，也无特效的防治方法，因此探讨和阐明VD的发病机理，对于临床制定更加合理的治疗方案具有重要的价值和理论意义。 丁苯酞(dl-3n-butylphthalide NBP)系从食用植物芹菜籽中提取并经消旋合成的黄色油状液体。该药为国家治疗脑缺血的一类新药，国外对该药的研究尚未见报道，国内冯亦璞等对丁苯酞治疗脑缺血的相关机制做了大量的实验研究，发现丁苯酞具有多靶点抗脑缺血作用，能改善线粒体功能，提高脑血管内皮NO和PGI2的水平，抑制谷氨酸释放，降低细胞内钙浓度和花生四烯酸含量，抑制自由基和提高抗氧化酶活性，减轻脑缺血所致脑水肿，抗血栓形成和抗血小板聚集，缩小脑梗死面积，改善局部脑血流量和细胞能量代谢、神经功能缺失及脑缺血记忆障碍。作为一种抗脑缺血新药，丁苯酞已广泛应用于脑血管病的治疗，但该药对VD的实验研究尚未见相关报道。 基于此，本实验通过建立VD模型及观察其海马形态，观测海马CHAT的变化，探讨VD发病的胆碱能机制及丁苯酞改善脑缺血，提高VD小鼠学习、记忆的胆碱能药理机制。 方法： 1.采用三次双侧颈总动脉结扎，造成脑组织反复缺血/再灌注，建立了小鼠VD模型，建立假手术组排除手术本身对小鼠的影响，通过跳台试验和水迷富试验进行学习和记忆成绩测试，观察其行为学改变；用HE染色观察海马病理学特征变化。 2.快速断头取脑，4％多聚甲醛溶液固定小鼠脑组织，用免疫组化在光镜下观察各组小鼠海马组织CHAT的表达变化，并且计算其海马CA1区CHAT阳性细胞的面密度值，比较各组海马的表达是否差异。 结果： 1.VD小鼠模型的行为学评价及海马病理学特征2 月龄雄性昆明小鼠56只，随机分为假手术对照组、VD模型组、丁苯酞预防治疗组、丁苯酞治疗组。采用双侧颈总动脉结扎，连续三次脑缺血(20 min)再灌注(10min)，建立VD小鼠模型。术后29d，各组分别进行跳台试验及水迷宫实验，测试学习成绩；术后30d测试记忆成绩。然后用HE染色观察各组小鼠海马组织病理学特征。 1.1 学习成绩术后第29天，分别进行跳台试验和水迷宫试验，测试跳台试验反应时间(sec)和错误次数(number/5 min)作为学习成绩，水迷宫试验游完全程时间(sec)和错误次数(number/3 min)作为学习成绩。 跳台试验结果显示：(1)与假手术对照组的反应时间(48.76±9.24)s比较，VD模型组小鼠学习阶段的反应时间(89.41±12.08)s明显延长(P<0.01)；(2)与VD模型组的反应时间比较，丁苯酞治疗组小鼠学习阶段的反应时间(59.68±10.27)s及丁苯酞预防治疗组小鼠学习阶段的的反应时间(57.23±10.05)s均明显缩短(P<0.01)；(3)与假手术对照组的错误次数(1.23±0.27)比较，VD模型组小鼠学习阶段的错误次数(3.74±0.42)明显增加(P<0.01)；(4)与VD模型组的错误次数比较，丁苯酞治疗组小鼠学习阶段的错误次数(1.52±0.38)及丁苯酞预防治疗组小鼠学习阶段的错误次数(1.48±0.31)均明显减少(P<0.01)；(5)假手术对照组、丁苯酞治疗组、丁苯酞预防治疗组之间的学习成绩无显著性差异(P>0.05)。 水迷宫试验结果显示：(1)与假手术对照组的游全程时间(87.32±13.46)s比较，VD模型组小鼠学习阶段的游全程时间(145.80±13.29)s明显延长(P<0.01)；(2)与VD模型组的游全程时间比较，丁苯酞治疗组小鼠学习阶段的游全程时间(101.89±18.38)s及丁苯酞预防治疗组小鼠学习阶段的游全程时间(99.18±11.25)s明显缩短(P<0.01)；(3)与假手术对照组的错误次数(16.88±4.19)比较，模型组小鼠学习阶段的错误次数(34.60±5.92)明显增多(P<0.01)；(4)与VD模型组的错误次数比较，丁苯酞治疗组小鼠学习阶段的错误次数(18.71±4.35)及丁苯酞预防治疗组小鼠学习阶段的错误次数(17.29±4.82)明显减少(P<0.01)；(5)假手术对照组、丁苯酞预防治疗组、丁苯酞治疗组的学习成绩之间无显著性差异(P>0.05)。以上结果提示VD模型小鼠的学习成绩降低，丁苯酞可以改善其学习成绩。 1.2记忆成绩术后第30天，分别进行跳台试验和水迷宫试验，测试跳台试验潜伏时间(sec)和错误次数(number/5min)作为记忆成绩，水迷宫试验游完全程时间(sec)和错误次数(number/3min)作为记忆成绩。 跳台试验结果显示：(1)与假手术对照组的潜伏时间(148.92±20.83)s比较，VD模型组小鼠记忆阶段的潜伏时间(78.67±19.17)s明显缩短(P<0.01)；(2)与VD模型组的潜伏时间比较，丁苯酞治疗组小鼠记忆阶段的潜伏时间(131.41±18.82)s及丁苯酞预防治疗组小鼠记忆阶段的的潜伏时间(128.57±18.29)s均明显延长(P<0.01)；(3)与假手术对照组的错误次数(0.32±0.05)比较，VD模型组小鼠记忆阶段的错误次数(1.72±0.13)明显增加(P<0.01)；(4)与VD模型组的错误次数比较，丁苯酞治疗组小鼠记忆阶段的错误次数(0.54±0.08)及丁苯酞预防治疗组小鼠记忆阶段的的错误次数(0.50±0.07)均明显减少(P<0.01)；(5)假手术对照组、丁苯酞预防治疗组、丁苯酞治疗组之间的记忆成绩无显著性差异(P>0.05)。结果提示VD模型小鼠的记忆成绩降低，丁苯酞可以改善其记忆成绩。水迷宫试验结果显示：(1)与假手术对照组的游全程时间(67.82±8.79)比较，VD模型组小鼠记忆阶段的游全程时间(137.40±11.86)明显延长(P<0.01)；(2)与VD模型组的游全程时间比较，丁苯酞治疗组小鼠记忆阶段的游全程时间(88.73±9.53)及丁苯酞预防治疗组小鼠记忆阶段的游全程时间(83.87±8.62)明显缩短(P<0.01)；(3)与假手术对照组的错误次数(9.57±2.91)比较，模型组小鼠记忆阶段的错误次数(20.90±4.25)明显增多。(P<0.01)；(4)与VD模型缱的错误次数比较，丁苯酞治疗组小鼠记忆阶段的错误次数(11.17±3.04)及丁苯酞预防治疗组小鼠记忆阶段的错误次数(10.27±2.83)明显减少(P<0.01)；(5)假手术对照组、丁苯酞治疗组、丁苯酞预防治疗组的记忆成绩之间无显著性差异(P>0.05)。 以上结果提示VD模型小鼠的记忆成绩降低，丁苯酞可以改善其记忆成绩。 1.3 VD小鼠海马病理学改变在光镜下，(1)假手术对照组小鼠海马CA1区锥体缨胞核大而圆，核仁明显，细胞排列较致密整齐。(2)相比之下，VD模型组小鼠海马CA1区锥体细胞松散，层次不清，有细胞缺失现象；炎性细胞浸润；部分细胞旁有空染区，核固缩、胞质浓染、胞体变小，并且有胶质细胞增生形成结节。(3)丁苯酞治疗组和预防治疗组小鼠海马CA1区锥体细胞排列尚整齐，未发现炎性细胞浸润，核固缩现象较少见。 2.VD小鼠海马CA1区CHAT表达水平及丁苯酞的影响2.1 CHAT免疫组化染色小鼠10％水合氯醛麻醉，4％多聚甲醛灌注固定，石蜡包埋，冠状切片，采用SP法行免疫组化染色，观察CHAT阳性神经元数目的变化。结果显示：(1)与假手术对照组海马CA1区CHAT阳性神经元面密度值为：(0.1178±0.0104)比较，VD模型组小鼠海马CA1区CHAT阳性神经元面密度值(0.0823±0.0236)明显减少(P<0.05)；(2)与VD模型组比较，丁苯酞治疗组小鼠海马CA1区CHAT阳性神经元面密度值(0.1097±0.0131)和丁苯酞预防组小鼠海马CA1区CHAT阳性神经元面密度值(0.1116±0.0135)明显增多(P<0.05)；(3)丁苯酞治疗组、丁苯酞预防治疗组、假手术对照组海马CA1区CHAT阳性神经元面密度之间无明显差异(P>0.05)。此可以提示VD小鼠海马CA1区GHAT水平降低参与了VD的发病机制，丁苯酞和丁苯酞预防治疗组可以防止VD小鼠海马CA1区CHAT水平表达下降而促进其学习和记忆成绩的改善。 结论： 1.本实验建立的VD小鼠模型可模拟人类VD以学习和记忆能力缺损为主的认知功能障碍，是研究VD比较理想的动物模型，对深入研究VD是可行的。VD模型小鼠海马CA1区出现病理性变化。 2.VD小鼠海马CHAT蛋白表达水平降低，与其学习和记忆成绩下降相一致，提示CHAT表达水平降低可能参与了VD的发病。 丁苯酞在改善VD小鼠学习和记忆成绩的同时，可显著增加VD小鼠海马细胞内CHAT的表达水平，从而发挥对VD的治疗作用，并且改善了海马组织CA1区病变，此与其学习和记忆成绩改善相一致。提示此药可能具有改善VD的新药理学作用。

目录

论文说明：英文缩写

声明

摘要

引言

第一部分 血管性痴呆小鼠模型的评价及丁苯酞的治疗作用

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

第二部分 血管性痴呆小鼠海马CA1区CHAT蛋白表达水平变化及丁苯酞的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述：中枢胆碱能系统损伤与痴呆

致谢

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