Survivin反义寡核苷酸治疗人涎腺腺样囊性癌的实验研究

摘要

目的：涎腺腺样囊性癌(SACC)，是一种常见的涎腺恶性肿瘤。其恶性程度高，侵袭性强，易复发、易早期转移。且对放疗、化疗不敏感，手术治疗难以根除。因此，寻求有效的辅助性治疗手段非常必要。survivin是新近发现的凋亡抑制蛋白(IAP)家族的新成员，特异表达于人的胚胎组织以及多数人类肿瘤细胞。在成人，由于survivin主要特异地表达于肿瘤组织，使得反义survivin基因治疗具有良好的靶向性、特异性及安全性。本实验利用人涎腺腺样囊性癌高转移细胞系Acc-M探讨survivin反义寡核苷酸(ASODN)对survivin基因表达的影响，及其诱导肿瘤细胞凋亡的效果；同时建立Acc-M裸鼠移植瘤模型，探讨survivin反义寡核苷酸对该肿瘤细胞形态结构、细胞凋亡以及肿瘤生长速度的影响，为人涎腺腺样囊性癌的临床基因治疗提供实验依据。 方法： 1.材料 (1)人涎腺腺样囊性癌高转移细胞系(Acc-M)。 (2)针对survivin基因的反义寡核苷酸片段。 (3)15只SPF级雌性Balb/c裸小鼠，4-5周龄。 2.方法 (1)细胞培养：Acc-M细胞培养于RPMI1640含胎牛血清和双抗的培养液中，5％CO2、37℃恒温孵育。 (2)体外实验：设计合成针对survivin基因的反义寡核苷酸片段。脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染Acc-M细胞，通过RT-PCR，Western-blot检测survivin表达的改变，MTT测定细胞增殖抑制，流式细胞术测定细胞凋亡率。 (3)动物实验：建立裸鼠皮下移植模型，待肿瘤直径达1.0cm，采用survivin反义寡核苷酸联合脂质体作用于裸鼠移植瘤局部，并设正义管核苷酸(SODN)对照组和空白对照(NS)组，每4天瘤内注射一次，共治疗13天，第14天麻醉后处死裸鼠，观察移植瘤体积和瘤重的变化，流式细胞术测定细胞凋亡率，HE染色观察移植瘤结构改变。 结果： 1.转染ASODN组survivin表达下降，其中mRNA表达下降达43.03％，显著低于SODN组、脂质体组和空白对照组，蛋白表达下降36.03％，显著低于SODN组、脂质体组和空白对照组。细胞凋亡率明显提高，流式结果显示ASODN组细胞凋亡率为25.9％。而SODN组为1.98％，脂质体组2.08％，空白对照组为1.93％。前者与后三组各组间均有显著差异，而后三组之间无差别。MTT试验显示转染ASODN组细胞增殖明显受抑制，且与浓度有一定依赖性，ASODN组IR均增高，800nmol/L和1000nmol/L组细胞抑制率分别达37.61％和46.42％，显著高于其余各组。而SODN组、脂质体组与空白组间无明显差异。 2.裸鼠移植瘤治疗结束时，NS组、SODN组、ASODN组体积均数分别为(以cm3为单位)：3.09±0.06，2.92±0.13，1.309±0.27。ASODN组裸鼠肿瘤生长明显受到抑制，抑制率为57.6％。NS组、SODN组、ASODN组肿瘤质量均数分别为(以g为单位)：4.97±0.54，4.40±0.51，2.32±0.87，ASODN组抑瘤率为53.4％。肉眼观察：肿瘤椭圆形，结节状，有包膜，表面光滑，个别瘤体表面有破溃。剖面实性，灰白色，部分区域由黄白色豆渣样物，似坏死组织。光镜观察：肿瘤片状排列，细胞呈圆形或多边形，胞浆红染。胞核圆形，居中，核大而深染，核浆比例增大，异型性明显，核分裂像易见。ASODN组中可见成片的凋亡细胞，细胞体积缩小，胞浆固缩，可见凋亡小体。SODN、NS组肿瘤细胞成片生长，偶见凋亡细胞。流式细胞分析术检测显示ASODN组凋亡率达32.5％而SODN组、NS组凋亡率为6.22％和5.60％。 结论： 1.Survivin反义寡核苷酸能有效沉默涎腺腺样囊性癌中survivin的表达。 2.细胞培养和裸鼠移植瘤实验均证明Survivin反义寡核苷酸具有明显促进SACC细胞凋凋亡，抑制其增殖的作用。 3.Survivin反义寡核苷酸联合脂质体可作为SACC基因治疗的新途径，具有良好的临床应用前景。

目录

声明

摘要

前言

第一部分survivin反义寡核苷酸对人涎腺腺样囊性癌细胞凋亡的影响

材料与方法

结果

附图

第二部分survivin反义寡核苷酸对人涎腺腺样囊性癌裸鼠移植瘤的作用

材料与方法

结果

附图

讨论

结论

参考文献

综述survivin与细胞调亡、肿瘤的研究现状

致谢

个人简历