体外冲击波对体外培养兔关节软骨细胞增殖及相关生长因子活性的影响

摘要

目的：
　　 关节软骨缺损和损伤是骨关节外科常遇到的问题，常由创伤和各种疾病（如骨性关节炎、骨软骨炎、骨坏死等）引起。关节软骨损伤后自身修复能力有限，大的关节软骨缺损常由纤维软骨而不是正常的透明软骨修复。纤维软骨在生物化学和组织结构上与透明软骨不同，常因无力承担长时间的关节内各种机械应力而退变。目前，关于促进关节软骨缺损的修复、提高修复质量方面的研究颇多。但临床上尚无一种方法能高质量的修复关节软骨损伤并达到很好的远期疗效。
　　 体外冲击波疗法（Extracorporeal Shock Wave Therapy，ESWT）作为骨科领域兴起的新的非侵入性治疗方法，在治疗某些矫形外科和软组织疾病方面较传统外科方法存在许多优势。近年来，发现ESW在治疗骨性关节炎（Osteoarthritis，OA）中有显著疗效，其作用机制未见相关分子生物学研究报道。
　　 本课题利用体外培养的正常原代软骨细胞，施加不同能量强度的ESW刺激，探讨ESW是否对关节软骨细胞的增殖有影响，检测ESW对软骨细胞增殖情况的影响， ESW促进软骨修复作用的分子生物学机理、适合软骨细胞增殖的能量范围及ESW作为延缓OA发生发展的非侵入治疗方法的可行性，为下步临床应用提供理论依据。
　　 方法：
　　 选用健康的3月龄新西兰兔20只，酶法消化正常兔膝关节软骨获得软骨细胞。培养并传3代，用台盼蓝染色法测细胞存活率。将传3代的软骨细胞随机分为四组，A组：ESW能量0.5×105Pa，200次；B组：ESW能量1.5×105Pa，200次；C组：ESW能量2.5×1 05Pa，200次；D组：空白对照组。干预后培养48小时，通过台盼蓝染色计算细胞成活率，细胞爬片HE染色后倒置相差显微镜观察形态，干预后各组软骨细胞用台盼蓝染色检测细胞存活率，CCK-8法生长曲线观察增殖趋势，ELISA检测兔膝关节软骨细胞bFGF、PCNA、CTGF、Collagen Ⅱ变化情况分析干预效果，了解ESW对兔膝软骨细胞增殖活性的影响；用逆转录聚合酶链反应法检测bFGF、CTGF、Collagerl Ⅱ mRNA的表达。记录原始数据，各组数据以均数±标准差表示，两组间均数比较采用两样本t检验，运用SPSS13.0统计软件进行数据分析以相应的统计方法进行统计，以p<0.05表示有统计学意义。
　　 结果：
　　 1、台盼蓝染色检测细胞增殖：台盼蓝染色后，死细胞染成淡蓝色，而活细胞拒染，镜下观察发现，经ESW干预后，B组细胞活性为（95±3）％，与A组、C组、空白对照相比差异有统计学意义（P<0.05）。
　　 2、生长曲线：ESW对正常兔膝软骨细胞的影响显著，最佳能量频次200次和强度1.5×105Pa。ESW能量实验组A和实验组B在缓慢增长期和指数增长期均较实验组C和空白对照组有所增加（P<0.05）。但实验组B在第3日时间点与其他三组比较有统计学差异（P<0.05）。而且细胞增殖高峰提前，表明适当能量的ESW可以明显在时间和数量上促进软骨细胞的增殖。
　　 3、细胞爬片HE染色，倒置相差显微镜观察：酶法消化获得正常兔膝原代软骨细胞。倒置相差显微镜观察，刚分离的软骨细胞形态呈轮廓清晰的圆形，核明亮而清楚，具折光性、旋光性。悬浮在培养液中，细胞大小略有差异。4h后大部分细胞开始贴壁，细胞也逐渐变得扁平透亮。24小时后软骨细胞开始出现突起，细胞逐渐变成多边形。3天后，软骨细胞进入对数生长期，细胞连片生长，边缘细胞突起较长，细胞偏梭形，中央的细胞突起较短，呈多角形。7天软骨细胞呈“铺路石”样改变。8天后细胞数量增多，胞浆内容物增加，部分细胞形成细胞团块或软骨结节。
　　 4、ELISA检测 bFGF、PCNA、CTGF、Collagen Ⅱ显示：各实验组bFGF、PCNA、CTGF、Collagetl Ⅱ表达均有增加，有统计学差异（P<0.05）。尤其是对bFGF作用更加明显，实验组B（12.920±0.103）与空白对照组、实验组A能量组和实验组C相比有显著性差异（P<0.01）。说明ESW通过促进对软骨细胞有促增殖作用的生长因子的表达，来起到促进软骨细胞增殖的作用。
　　 5、RT-PCR法检测bFGF、CTGF、Collagetl Ⅱ的表达：实验组B中，各种生长因子的mRNA表达均较空白对照组增加，有统计学意义（P<0.05），其中CTGF和Collagerl Ⅱ mRNA的表达实验组A和实验组B之间没有统计学意义（P>0.05）。此结果反应出来的情况和ELISA法检测结果一致。
　　 结论：
　　 1、ESW作为机械应力在一定能量强度和频次的情况下可显著促进软骨细胞增殖。从细胞水平证实软骨细胞是对ESW应力敏感细胞，具有能量依赖性，为下步实验应用提供理论支持，为目前应用ESW治疗OA选用能量和次数参数提供参考范围。
　　 2、本实验通过ESW适当能量的干预，可以在较短时间内培养出数量较大的软骨细胞，为临床实验及组织工程中种子细胞提供充足的、表型稳定的细胞。
　　 3、ESW促进软骨细胞促增殖因子bFGF、CTGF表达，而这些生长因子反过来发挥软骨保护功能。进而说明ESW能有效低促进软骨细胞的增殖。综上ESW是一种有前途的无创性治疗OA的方法，具有重要的临床意义和实践意义。

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结果

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讨论

结论

参考文献

综述 软骨细胞增殖相关因子的研究进展

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