钙调神经磷酸酶及锌指转录因子在大鼠钙化主动脉中的作用

摘要

目的：血管壁上钙过量沉积称为血管钙化。动脉粥样硬化、慢性肾功能衰竭、糖尿病、高血压等疾病过程中均有血管钙化，其程度与疾病的严重性呈正相关，并随年龄的增长而逐渐恶化。心血管系统钙化包括动脉内膜（动脉粥样硬化相关钙化）、动脉中层（Monckeberg's sclerosis）和心脏瓣膜钙化，无论发生在哪个部位，都会引起血流动力学和机械力学的改变，并增加卒中和猝死的危险。近几年冠状动脉钙化对于心血管事件的预测价值备受关注，较无钙化者，任何程度的冠状动脉钙化整体相对危险度为4.3，3～5年冠心病事件（心肌梗死或心源性死亡）增加4倍。深入研究血管钙化的发病机制，预防、延缓或逆转血管钙化的发生，具有重要的临床意义。
　　 目前研究表明，血管钙化是由细胞和分子参与的、类似于骨形成的主动过程。许多因素都参与了这一过程的调节。近年证实钙调神经磷酸酶（CaN）是丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶家族成员，主要表达于细胞浆中，组织分布广泛，通过使底物NFATs去磷酸化和核内转位，激活下游基因包括锌指转录因子（GATA-6）等的转录，参与多种细胞功能调节。研究证实CaN及GATA-6在心肌细胞肥大和骨代谢中具有一定作用。CaN及GATA-6是否参与血管钙化的调节过程，目前国内外尚未见有相关报道。
　　 本试验采用华法令和维生素D3建立大鼠血管钙化模型，测定主动脉CaN mRNA、蛋白质的表达及活性和GATA-6 mRNA、蛋白质的表达，并观察CaN特异性抑制剂环孢霉素A（CsA）对CaN mRNA、蛋白质及GATA-6m RNA、蛋白质的表达及对血管钙化的影响，初步探讨CaN、GATA-6对血管钙化的调节作用，为临床防治血管钙化提供新的思路。
　　 方法：4w SD雄性大鼠36只，体重80～90g，随机分为3组，每组12只。A组：对照组；B组：钙化组：C组：环孢霉素A组；实验第1-8天，各组均给予维生素K115mg·kg-1·d-1，皮下注射。同时，c组另给予环孢霉素A10mg·kg-1·d-1腹腔注射；A组和B组分别给予等量生理盐水腹腔注射。第3天开始，B、C组另给予维生素D33×105U·kg-1·d-1，皮下注射，持续至实验第5天，及华法令15mg·100g-1，12h一次，皮下注射，持续至第8天；对照组在相同时间给予等量生理盐水皮下注射。实验第9天，所有动物麻醉后处死。开胸，暴露出心脏，分离胸主动脉，并向下剖开腹部，分离出腹主动脉，从主动脉根部至腹主动脉分叉处剪下主动脉。取材后每组各取6只用于CaNB1、GATA-6免疫组化染色、CaNAα mRNA、GATA-6 mRNA原位杂交测定和透射电镜下观察超微结构的变化；6只用于碱性磷酸酶（ALP）活性测定。将免疫组织化学和原位杂交结果应用Image-Pro Plus图象分析软件，分别计算各组主动脉组织相同面积内阳性细胞的累积光密度值（integrated optic density，IOD）。所有数据以均数±标准差（（）±s）表示，运用SPSS13.0统计软件，首先对计量资料进行正态性检验及方差齐性检验，组间资料比较应用单因素方差分析，两两比较应用LSD-t检验，P＜0.05即有统计学意义。
　　 结果：（1）HE染色结果示：对照组大鼠主动脉壁结构完整，中层血管平滑肌细胞（VSMCs）排列整齐；钙化组和环孢霉素A组大鼠主动脉中层VSMCs排列紊乱，弹力纤维迂曲断裂。（2）透射电镜下可见钙化大鼠主动脉内皮细胞呈空泡变性，线粒体水肿，嵴数量减少，排列紊乱，部分嵴和细胞膜融合或消失，粗面内质网轻度扩张，有脱颗粒现象，部分膜融合或消失，吞饮小泡数量减少，细胞核轻度水肿，部分双层核膜融合或消失，核轻度不规则；平滑肌细胞线粒体大部分嵴和部分核膜融合或消失，粗面内质网轻度扩张，有脱颗粒现象，部分核膜融合；平滑肌细胞外基质中可见钙盐沉积，有外膜包裹。（3）免疫组织化学结果示：对照组大鼠主动脉可见少量CaNB1蛋白表达，主要位于胞浆内；钙化组大鼠主动脉CaNB1蛋白（8731.93±469.92）较对照组（5500.95±982.57）表达明显增加（P＜0.01）；CsA组大鼠主动脉CaNB1蛋白（7712.79±539.20）较对照组（5500.95±982.57）表达明显增加（P＜0.01）；CsA组大鼠主动脉CaNB1蛋白（7712.79±539.20）较钙化组（8731.93±469.92）表达减少（P＜0.05）；对照组大鼠主动脉可见少量GATA-6蛋白表达，主要位于胞浆内；钙化组大鼠主动脉GATA-6蛋白（7660.05±794.99）较对照组（2484.51±369.20）表达增加（P＜0.05）；CsA组大鼠主动脉GATA-6蛋白（6508.20±821.83）较对照组（2484.51±369.20）表达明显（P＜0.05）；CsA组大鼠主动脉GATA-6蛋白（6508.20±821.83）较钙化组（7660.05±794.99）表达明显减少（P＜0.01）。（4）原位杂交结果显示：对照组大鼠主动脉可见GATA-6 mRNA表达，主要位于胞浆中；钙化组大鼠主动脉CaNAα mRNA（26420.97±1697.97）较对照组（10302.17±2636.06）表达明显增加（P＜0.01）；CsA组大鼠主动脉CaNAα mRNA（16775.25±4029.59）较对照组（10302.17±2636.06）表达明显增加（P＜0.01），CsA组大鼠主动脉CaNAα mRNA（16775.25+4029.59）与钙化组（26420.97±1697.97）比较表达明显减少（P＜0.01）；对照组大鼠主动脉可见少量GATA-6mRNA表达，主要位于胞浆内；钙化组大鼠主动脉GATA-6mRNA（16622.04±1449.89）较对照组（7608.71±684.26）表达明显增加（P＜0.01）；CsA组大鼠主动脉GATA-6 mRNA（10743.99±1060.04）较对照组（7608.71±684.26）表达明显增加（P＜0.01）；CsA组大鼠主动脉GATA-6 mRNA（7712.79±539.20）较钙化组（16622.04±1449.89）表达减少（P＜0.01）。（5）钙化组ALP活性（463.38±65.09U·gprot-1）较对照组（360.04±49.01 U·gprot-1）增加（P＜0.05）；CsA组ALP活性（479.78±74.67U-1gprot）较对照组（360.04±49.01 U·gprot-1）明显增加（P＜0.01），与钙化组（463.38±65.09U·gprot-1）比较无显著性差异（P＞0.05）。
　　 结论：1.本实验采用华法令和维生素D3皮下注射成功地建立了大鼠主动脉钙化模型，并且在透射电镜下观察了钙化大鼠主动脉超微结构的变化。2.本试验首次发现钙化大鼠主动脉中CaN mRNA和蛋白及GATA-6 mRNA和蛋白的表达和活性明显增加，说明CaN及GATA-6参与血管钙化的调节过程。3.免疫抑制剂CsA很可能促进血管钙化。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 钙调神经磷酸酶及锌指转录因子与血管钙化的关系

致谢

个人简历