TAT-血红素氧合酶-1融合蛋白对大鼠供肝冷保存期氧化和炎症反应的影响

摘要

目的：原位肝移植现已广泛用于终末期肝病治疗，有研究报导术后1年60-65％发生免疫排斥反应。其主要原因之一是供肝冷保存期氧化和炎性损伤。目前由于供肝资源紧缺，如何有效保护供肝，减少移植肝脏的无功能的发生率更加受到了人们的重视。HO-1蛋白是机体血红素分解代谢的限速酶，分解产生一氧化碳（CO）、胆绿素和Fe2+，具有抗氧化、抗炎症、抗凋亡、下调血管内皮细胞细胞间黏附分子表达、减少血管损伤、增加移植器官的血流灌注等作用，引起国内外学者的广泛关注。蛋白转导结构域（protein transduction domain，PTDs）是一小段可以直接透过细胞膜的多肽，蛋白质或多肽与PTDs相连后可进入细胞内发挥生物功能。HIV-1反式激活蛋白TAT是目前研究较多的PTDs之一。TAT可将与其相连的蛋白转导入肝、肾、心肌以及脑等器官组织。有研究证实，TAT与HO-1的融合蛋白（TAT-HO-1）可以成功转导进入胰腺βTC-3细胞，并可显著提高细胞活力。本研究前期实验证实TAT-HO-1可以转导进入大鼠在体肝组织细胞，证实其可清除自由基，增强超氧化物歧化酶（SOD）活性，减轻脂质过氧化反应。本研究在前期研究基础上，对TAT-HO-1在大鼠供肝冷保存期间是否能进入肝组织细胞以及是否有效对供肝提供抗氧化和抗炎症之保护作用，进行进一步探讨。
　　 方法：对含有TAT-HO-1-pET32a质粒的E.coli BL-21（DE3）菌株进行培养，用IPTG诱导TAT-HO-1-pET32a表达、Ni-NTA-agarose纯化，Western blot法对TAT-HO-1进行定性分析，化学法检测TAT-HO-1活性，证实所得蛋白为有活性的TAT-HO-1融合蛋白后进行动物实验。
　　 选择雄性SD大鼠60只，体重250～300g。其中，12只用于TAT-HO-1转导进入肝脏情况的研究。48只用于TAT-HO-1对冷保存肝脏保护作用的研究。根据所用保存液的不同按照随机数字表分为两组：C组，肝脏应用4℃HTK液进行灌注和冷保存；P组，肝脏应用4℃含TAT-HO-150μg/ml的HTK液进行灌注和冷保存。参照Kamada等的方法切取肝脏。取下肝脏置于相应保存液40ml中4℃保存。各组分别于冷保存0h、6h、12h和18h取材，抽取保存液及肝组织标本立即置于-80℃冰箱保存。
　　 应用免疫组化染色法检测肝脏组织HO-1含量，分析TAT-HO-1转导进入肝脏的情况。应用Selectra-E全自动生化分析仪（Vital，荷兰）测定保存液中谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）和乳酸脱氢酶（LDH）含量。硫代巴比妥酸（TBA）法测定肝组织中MDA含量，黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性。采用免疫组化法检测肿瘤坏死因子（TNF-α）（试剂盒有武汉博士德生物试剂公司提供）。苏木素-伊红（HE）染色，在光镜和电镜下观察供肝组织形态学改变。
　　 结果：
　　 1、纯化所得蛋白为TAT-HO-1蛋白，该蛋白可在冷保存期转导进入大鼠肝脏。
　　 2、保存液中ALT、AST及LDH水平测定结果：
　　 组内比较：两组保存液中ALT、AST及LDH浓度均随着保存时间的延长而增高，上述指标，两两时间点比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。组间比较：在冷保存0h时，两组保存液中ALT、AST及LDH浓度差异无统计学意义（P>0.05）；在6h、12h和18h保存时间点，蛋白组保存液中ALT、AST及LDH浓度明显低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　 3、组织中SOD活性、MDA和TNF-α含量测定结果：
　　 组内比较：两组肝组织中MDA和TNF-α含量均随保存时间延长而增高，这两个指标，两两时间点比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；肝组织中SOD活性随保存时间延长而降低，两两时间点比较，差异有统计学意义（P<0.05）。组间比较：在保存0h时，两组肝组织中SOD活性、MDA和TNF-α含量，差异无统计学意义（P>0.05）；在6h、12h和18h时，蛋白组肝组织中MDA和TNF-α含量明显低于HTK组，SOD活性则明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　 4、组织病理学观察结果：
　　 光镜下：在冷保存0h时两组肝窦、肝细胞索结构清晰，肝细胞轮廓清晰，细胞轻度肿胀，无细胞坏死。随着冷保存时间的延长，肝窦、肝细胞索结构逐渐消失，肝细胞肿胀加重、水样变性明显，多灶状肝细胞坏死增多。在6h、12h和18 h时，蛋白组损伤程度轻于HTK组。
　　 电镜下：随着冷保存时间的延长，可见线粒体肿胀逐渐加重，嵴变短，数目减少（由50％-60％减少至5％-10％），粗面内质网扩张加重，脱颗粒现象明显。在6h、12h和18h时，蛋白组损伤程度轻于HTK组。
　　 结论：TAT-HO-1可在冷保存期转导进入大鼠肝脏。HTK液中加入TAT-HO-1可以减轻供肝冷保存损伤，且保存效果优于单纯HTK液，其机制可能与HO-1抗炎症、抗氧化作用有关。

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结果

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附表

讨论

结论

参考文献

综述 血红素加氧酶-1对器官移植保护作用的研究进展

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