甲醛炎性痛诱导大鼠脊髓HO-1蛋白表达增加机制初探

摘要

目的：以往的研究己证实，甲醛炎性痛引起的伤害性信息传入可诱导脊髓血红素氧合酶-1（Heme oxygenase-1，HO-1）表达增多，脊髓内HO-1表达增多以及内源性一氧化碳（Carbon monoxide，CO）产生增多在痛感觉和痛觉过敏产生中发挥重要作用。但甲醛炎性痛引起的伤害性信息传入诱导的脊髓HO-1表达增多的机制尚未见相关报道。
　　 已有大量的研究资料表明，外周组织炎性痛引起伤害性信息传入脊髓，可引起初级神经元释放大量的以兴奋性氨基酸（excitatory amino acids，EAAs）为主的神经递质，其作用于脊髓二级神经元受体，引起细胞内信号转导分子一氧化氮（nitric oxide，NO）产生增加和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）激活，这些改变均参与痛感知及痛过敏的形成过程。在我室以往的研究中，曾观察了鞘内注射N-甲基-D-天门冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受体拮抗剂MK-801或PKC抑制剂CH对甲醛炎性痛诱导的脊髓NOS表达和NO产生的影响，发现二者均可抑制甲醛炎性痛诱导的脊髓NOS表达和NO的产生，证明甲醛炎性痛时脊髓后角NO的产生，除受NMDA受体激活状态调控以外，也受胞内信号转导分子PKC的调控。
　　 目前已证明，NOS/NO和HO/CO两个系统之间存在着密切的联系。大鼠甲醛炎性痛时脊髓内HO-1表达增多是否也与NMDA受体激活以及胞内信号转导分子PKC活化有关，尚有待进一步研究加以证实。
　　 本实验通过观察甲醛炎性痛大鼠鞘给予NMDA受体拮抗剂MK-801以及PKC选择性抑制剂灯盏花素乙（chelerythrine chloride，CH）及正常大鼠鞘内内给予NMDA受体选择性激动剂NMDA以及PKC激动剂佛泼醇脂（Phorbol12-Myrstate-Acetate，PMA），观察二者对甲醛炎性痛大鼠以及正常大鼠脊髓HO-1表达的影响，探讨甲醛炎性痛诱导的大鼠脊髓HO-1蛋白表达改变是否受NMDA受体激活以及PKC活化状态调控，探讨甲醛炎性痛大鼠脊髓HO-1蛋白表达增加的机制。
　　 1.NMDA受体激活在甲醛炎性痛诱导脊髓HO-1蛋白表达中的作用
　　 方法：雄性Sprague-Dawley大鼠35只，体重280±20g，由河北医科大学实验动物中心提供。将大鼠随机分为5组，分别为：①对照组（Control），②甲醛组（FM），③甲醛+生理盐水组（FM+NS），④甲醛+MK-801组（FM+MK-801）。⑤NMDA组，每组7只动物，Control组不加任何处理，直接断头取脊髓。FM组大鼠于右后掌皮下注射5％甲醛溶液0.2ml，于注射甲醛后24h断头取材。FM+NS和FM+MK-801组大鼠分别预先鞘内注射NS或NMDA受体抑制剂MK-801溶液，15 min后于右后掌皮下注射甲醛溶液0.2ml，于注射甲醛后24h断头取材。NMDA组为正常大鼠鞘内注射NMDA受体激动剂NMDA溶液，于鞘内注射后24h时断头取材。采用免疫组织化学方法观察脊髓HO-1蛋白表达。
　　 结果发现，Control组大鼠L5节段双侧脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板层HO-1阳性细胞较少，多呈菱形，一些为圆形或卵圆形，部分细胞可见明显的突起及细长的神经纤维，这些细胞符合神经元的形态特征。
　　 与Control组相比，FM组双侧脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板层HO-1阳性细胞的数目明显增加（P<0.01），并且这些阳性细胞的染色深度亦明显增加（P<0.01），表明甲醛炎性痛可诱导脊髓后角HO-1表达增加。FM+NS组和FM组两组相比无显著性差异，表明鞘内注射溶剂NS对HO-1表达无明显影响。与FM组比较，FM+MK-801组大鼠双侧脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板层HO-1阳性细胞的数目明显减少（P<0.01），并且这些阳性细胞的染色深度亦明显降低（P<0.01）；表明阻断NMDA受体，可以明显抑制甲醛炎性痛诱导的脊髓后角HO-1蛋白的表达。与Control组相比，正常大鼠鞘内注射NMDA溶液后，动物出现了烦躁不安，舔咬物品，抓盒底，自发退缩等伤害性感受行为。同时大鼠双侧脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板层HO-1阳性细胞的数目明显增多（P<0.01），并且HO-1阳性细胞染色深度明显增加，这一结果进一步证明，NMDA受体激活可促进脊髓神经元HO-1蛋白的表达。
　　 2.蛋白激酶C活化对甲醛炎性痛诱导的脊髓HO-1蛋白表达的影响
　　 雄性Spmgue-Dawley大鼠35只，体重280±20克，由河北医科大学实验动物中心提供。大鼠被随机分为5组：①对照组（Control），②甲醛组（FM），③甲醛+二甲基亚砜组（FM+DMSO），④甲醛+CH组（FM+CH）。⑤PMA组，每组7只动物。对照组不加任何处理，直接断头取材。FM组大鼠于右后掌皮下注射5％甲醛溶液0.2ml，于注射甲醛后24h断头取材。FM+DMSO组和FM+CH组动物于注射甲醛前15min，鞘内分别注射10％二甲基亚砜溶液（DMSO，为CH和PMA溶剂）或10nmol CH，注射甲醛后24h断头取材；PMA组为正常大鼠，首先鞘内注射含有0.8nmol的PKC激动剂PMA溶液。于鞘内注射后24h时断头取材。采用免疫组织化学方法观察脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板层HO-1蛋白表达。
　　 结果发现，与Control组相比，FM组和FM+DMSO组大鼠L5节段两侧脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板层内HO-1阳性细胞数目明显增加，且染色明显加深（P<0.01），而FM组和FM+DMSO组两组相比无显著性差异（P>0.05），说明鞘内注射二甲基亚砜溶液对HO-1表达无明显影响。与FM组比较，FM+CH组大鼠脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板层内HO-1阳性细胞的数目明显减少，阳性细胞染色明显变浅（P<0.01），但仍高于Control组水平。表明抑制PKC活化可以抑制甲醛炎性痛诱导的HO-1蛋白表达增加。正常大鼠鞘内注射PMA后，动物出现了烦躁不安，舔咬物品，抓盒底，自发退缩等伤害性感受行为。同时脊髓神经元HO-1蛋白表达发生明显改变。与Control组相比，PMA组大鼠L5节段脊髓后角Ⅰ-Ⅱ板层内HO-1阳性细胞数目明显增多（P<0.01），阳性细胞平均光密度明显增加（P<0.05），表明染色明显加深。这一结果进一步证实，PKC激活可促进脊髓神经元HO-1蛋白的表达。
　　 结论：
　　 鞘内注射NMDA受体拮抗剂MK-801可以抑制甲醛炎性痛诱导的HO-1蛋白表达增加，正常大鼠鞘内注射NMDA受体激动剂NMDA可促进大鼠脊髓HO-1蛋白表达；表明甲醛炎性痛诱导的脊髓HO-1蛋白表达受NMDA受体调控。
　　 鞘内注射PKC抑制剂CH能抑制甲醛炎性痛诱导的大鼠脊髓HO-1蛋白表达，正常大鼠鞘内注射PKC激动剂PMA则可促进大鼠脊髓HO-1蛋白表达；表明甲醛炎性痛诱导的大鼠脊髓HO-1蛋白表达也受PKC活化状态调控。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

第一部分NMDA受体激活在甲醛炎性痛诱导脊髓HO-1蛋白表达的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分PKC对甲醛炎性痛大鼠脊髓HO-1表达的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

综述 HO-1表达诱导因素及其调控机制研究进展

致谢

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