过继转输不同来源父系淋巴细胞诱导妊娠丢失孕鼠T细胞免疫耐受机制的研究

摘要

目的：在正常妊娠过程中，胎儿作为半同种异体移植物而未被母体排斥，实际上反映了母体对胚胎的免疫耐受。其中，受孕后母体外周及母-胎界面免疫细胞功能变化是维持母胎免疫耐受平衡状态的关键。目前国内外研究多采用父方淋巴细胞免疫治疗不明原因复发性流产(Unexplainedrecurrent spontaneous abortion，URSA)，但是尚存在细胞来源不稳定、规范程度不高、个体之间差异较大、各实验室疗效不一等不足，且有关其免疫作用机制尚存疑点和分歧。
　　 本研究通过分析母体T细胞功能变化与妊娠丢失之间的关系，探讨过继转输不同来源的父系外周淋巴细胞进行免疫干预后，对妊娠丢失孕鼠母胎免疫耐受的诱导作用，为进一步研究URSA的免疫学发病机制及下一步指导临床合理规范化进行过继免疫治疗提供实验基础和理论依据。
　　 方法：
　　 1.建立妊娠丢失实验动物模型及实验分组：将雌雄小鼠随机分为5组后按2:1合笼交配；CBA/J(♀)×DBA/2(♂)为URSA组，CBA/J(♀)×BALB/c(♂)为正常妊娠对照组。再将URSA组的3组CBA/J雌鼠于孕4天（着床期）分别给予尾静脉注射父方（同笼DBA/2雄鼠）、非父方（非同笼DBA/2雄鼠）、无关个体(BALB/c雄鼠)外周单个核细胞，分别为治疗Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组；第4组CBA/J雌鼠注射等量生理盐水，作为未经免疫干预的URSA组。
　　 2.胚胎发育情况观察：于妊娠第14天分别处死各组CBA/J孕鼠，测量胎盘体积、计数吸收胚胎数和存活胚胎数，计算胚胎吸收率及流产发生率。
　　 3.孕鼠外周T细胞免疫功能检测：妊娠第14天分别处死各组CBA/J孕鼠，无菌解剖取脾，制备单个细胞悬液。采用噻唑蓝(MTT)染色法检测ConA诱导T细胞转化的A492值；细胞经破膜处理后直接荧光标记流式细胞计数(FCM)分别检测Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ以及Th2型细胞因子IL-4、IL-10的表达。
　　 4.孕鼠母胎界面免疫抑制状况的分析：妊娠第14天分别处死各组CBA/J孕鼠，无菌解剖取胎盘组织，制备石蜡包埋切片。HE染色后光镜下分别以矩形走形计数200个免疫细胞，计数大颗粒淋巴细胞(LGL)，小淋巴细胞，巨噬细胞(Mφ)等，计算各类免疫细胞的百分率。免疫组化染色后进行图像分析，以灰度值(GS)分析TGF-β1、IL-10、COX-2等免疫抑制分子的表达强度，GS值大小与阳性表达强度呈反比；光镜下以矩形走形计数200个细胞，分别计算阳性细胞百分率。
　　 5.统计学处理：应用SPSS13.0版本软件对各组数据进行正态性、方差齐性检验后，以卡方检验比较各组之间胚胎吸收率及胎盘组织阳性细胞百分率之间的差异，单因素方差分析比较各组孕鼠脾细胞中Th1/Th2型细胞因子、胎盘组织免疫抑制分子的表达是否存在差异。
　　 结果：
　　 1.过继转输不同来源父系淋巴细胞对妊娠丢失孕鼠胚胎发育的影响妊娠丢失孕鼠(URSA组)的胚胎吸收率为22.58％，而正常妊娠动物模型孕鼠(Control组)的胚胎吸收率为5.23％，过继转输父系淋巴细胞治疗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组胚胎吸收率分别为5.50％、5.17％、5.84％;与未经治疗的URSA组相比，治疗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组胚胎吸收率均显著下降（均P＜0.05）；三组组间比较无明显差异(P＞0.05)，且均下降至正常妊娠对照组水平(均P＞0.05)。
　　 URSA组的流产发生率为44％，而Control组的流产发生率为20％。过继转输父系淋巴细胞治疗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组流产发生率分别为24％、16％、20％;与未经治疗的URSA组相比，治疗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组流产发生率显著下降(均P＜0.05)，三组组间比较无明显差异（P＞0.05），且均下降至正常妊娠对照组水平(均P＞0.05)。
　　 2.过继转输不同来源父系淋巴细胞对妊娠丢失孕鼠外周T细胞免疫功能的影响
　　 2.1 ConA诱导T淋巴细胞转化功能检测未经ConA诱导转化时，与未孕CBA/J雌鼠脾细胞培养72h后A492值(0.198±0.074)相比较，正常妊娠组（Control组）、未经诱导的URSA组及三组经父系细胞免疫干预的治疗组孕鼠脾细胞的A492值均显著升高(均P＜0.05)。其中，正常妊娠组与未经治疗的URSA组之间无明显差异（分别为0.798±0.114、0.812±0.138，P＞0.05)，治疗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组之间无明显差异（分别为0.699±0.315、0.659±0.134、0.632±0.132，P＞0.05），但较正常妊娠、未经治疗组相比均显著下调(均P＜0.05)。
　　 经ConA诱导转化后，与未孕CBA/J雌鼠脾细胞转化A492值（1.221±0.034）相比较，正常妊娠组（Control组）、未经诱导的URSA组及三组经父系细胞免疫干预的治疗组孕鼠脾细胞转化均显著下降（均P＜0.05。其中与正常妊娠组（1.011±0.134）相比较，未经治疗的URSA组虽有所下降，但统计学差异不显著（1.001±0.178，P＞0.05）；治疗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组之间无明显差异(分别为0.829±0.211、0.859±0.195、0.812±0.168，P＞0.05)，均较正常妊娠、未经治疗组相比均显著下调(均P＜0.05)。
　　 2.2 外周淋巴细胞Th1/Th2细胞功能检测
　　 2.2.1 Th1型细胞因子的表达与正常妊娠对照组脾细胞IL-2表达百分率（6.40％±0.92％）相比，URSA组表达百分率显著增高(19.73％±2.05％，P＜0.01)；经过继转输干预后治疗Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达的百分率显著降低至正常妊娠对照组水平(分别为6.39％±1.21％、6.68％±1.07％、6.42％±1.21％，均P＜0.01)。Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达的百分率组间比较无明显差异（P＞0.05）。
　　 与正常妊娠对照组脾细胞IFN-γ表达百分率(7.41％±0.73％)相比，URSA组表达的百分率显著增高(11.48％±1.10％，P＜0.01)；经过继转输干预后治疗Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达的百分率显著降低(分别为7.91％±0.76％、7.78％±0.82％、7.43％±1.11％，均P＜0.01)至正常妊娠对照组水平。Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达的百分率组间比较无明显差异(P＞0.05)。
　　 2.2.2 Th2型细胞因子的表达与正常妊娠对照组脾细胞IL-4表达百分率（8.16％±0.92％）相比，URSA组表达百分率显著降低(5.85％±0.57％，P＜0.05);经过继转输干预后治疗Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达的百分率显著增高(分别为9.87％±1.04％、9.03％±0.91％、8.96％±1.11％，均P＜0.05)至正常妊娠对照组水平。Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达的百分率组间比较无明显差异(P＞0.05）。
　　 与正常妊娠对照组脾细胞IL-10表达百分率（5.06％±0.78％）相比，URSA组表达百分率显著降低（3.94％±0.52％，P＜0.05）；经过继转输干预后治疗Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达的百分率显著增高（分别为5.93％±0.56％、5.94％±0.85％、6.12±0.96％，均P＜0.05)至正常妊娠对照组水平。Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达的百分率组间比较无明显差异(P＞0.05）。
　　 3.过继转输不同来源父系淋巴细胞对妊娠丢失孕鼠胎盘局部免疫抑制状态的影响
　　 3.1 胎盘组织中免疫细胞数量分析各组胎盘绒毛中均散在可见巨噬细胞(Mφ)、大颗粒淋巴细胞（Largegranulan lymphocyte，LGL）、小淋巴细胞等免疫细胞。正常妊娠对照组各类细胞百分率分别为17.85％±6.23％、65.25％±6.68％、15.10％±4.42％，URSA组分别为19.85％±18.86％、64.85％±4.28％、12.60％±4.32％，治疗Ⅰ组分别为18.85％±4.25％、65.20％±6.48％、15.95％±6.48％，治疗Ⅱ组分别为18.73％±5.03％、68.11％±5.32％、13.16％±4.65％，治疗Ⅲ组分别为17.87％±4.32％、67.41％±4.57、14.72％±3.82％，各组之间均无明显统计学意义(均P＞0.05)。各组总淋巴细胞百分率分别为82.25％±6.28％、80.15％±5.63％、81.14％±4.27％、81.28％±5.01％、82.30％±4.63％，相互之间均无明显差异(均P＞0.05)。
　　 3.2 母胎界面免疫抑制因子表达分析各组胎盘滋养细胞、血管内皮细胞及免疫细胞胞浆中均可见散在或片状的TGF-β1、IL-10、COX-2阳性表达。
　　 3.2.1 免疫抑制分子阳性细胞表达率分析与正常妊娠对照组胎盘组织中TGF-β1阳性细胞表达率(72.35％±5.47％)相比，URSA组阳性细胞表达率显著降低（50.45％±5.39％）；经过继转输干预后治疗Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达的百分率均显著增高(分别为63.73％±5.12％、70.27％±3.94％、73.34％±5.44％，均P＜0.05)至正常妊娠对照组水平。Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达的百分率组间比较无明显差异(P＞0.05)。
　　 与正常妊娠对照组胎盘组织中IL-10阳性细胞表达率(69.25％±6.37％)相比，URSA组阳性细胞表达率显著降低(48.75％±4.32％，P＜0.05)；经过继转输干预后治疗Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达的百分率均显著增高(分别为71.25％±5.17％、76.57％±2.98％、65.98％±5.45％，均P＜0.05)至正常妊娠对照组水平。Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达的百分率组间比较无明显差异(P＞0.05)。
　　 与正常妊娠对照组胎盘组织中COX-2阳性细胞表达率(81.05％±4.43％)相比，URSA组阳性细胞表达率显著降低（52.24％±4.04％P＜0.05）：经过继转输干预后治疗Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达的百分率均显著增高(分别为71.08％±3.78％、69.87％±4.34％、70.69％±3.74％，均P＜0.05)至正常妊娠对照组水平。Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达的百分率组间比较无明显差异(P＞0.05）。
　　 3.2.2 免疫抑制分子阳性表达强度分析与正常妊娠对照组胎盘组织中TGF-β1表达强度(71.60±7.04)相比较，URSA组表达强度显著降低(95.84±5.65，P＜0.05)；经过继转输干预后治疗Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达强度显著增高(分别为74.36±5.74、75.20±8.76、72.60±7.2，均P＜0.05)至正常妊娠对照组水平。Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达的百分率组间比较无明显差异（P＞0.05）。
　　 与正常妊娠对照组胎盘组织中IL-10表达强度(92.50±6.47)相比，URSA组表达强度显著降低(118.50±8.61，P＜0.05)；经过继转输干预后治疗Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达强度显著增高(分别为94.00±6.54、100.20±6.53、100.80±11.49，均P＜0.05)至正常妊娠对照组水平。Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达的百分率组间比较无明显差异（P＞0.05）。
　　 与正常妊娠对照组胎盘组织中COX-2表达强度(82.60±5.37％)相比，URSA组表达强度显著降低(96.92±5.42，P＜0.05)；经过继转输干预后治疗Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达强度显著增高(分别为84.24±5.08、82.70±8.1、81.40±6.8，均P＜0.05)至正常妊娠对照组水平。Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组表达的百分率组间比较无明显差异(P＞0.05）。
　　 结论：
　　 1.妊娠期T细胞免疫耐受的维持在正常妊娠过程中发挥了关键作用，耐受缺失或不足是妊娠丢失的重要机制之一。
　　 2.TGF-β1、IL-10、COX-2等免疫抑制分子在胎盘组织中的低水平表达可能与复发性流产密切相关。
　　 3.过继转输父系外周淋巴细胞可有效诱导母胎免疫耐受，有利于妊娠的正常进行。父方、非父方等不同雄鼠来源的外周淋巴细胞均可发挥相似的诱导效应。
　　 4.不同来源的父系外周淋巴细胞通过共同途径引发母体Th2偏移、胎盘适度的局部免疫抑制，有效诱导母胎免疫耐受。

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过继转输不同来源父系淋巴细胞诱导妊娠丢失孕鼠T细胞免疫耐受机制的研究

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结果

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结论

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综述 复发性自然流产的临床病因研究进展

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