磨牙缺失对KM、SAMP8和ICR小鼠学习记忆能力的影响及长苞凹舌兰提取物CE对磨牙缺失后小鼠学习记忆能力的改善

摘要

研究显示,咀嚼能够影响海马学习记忆相关的认知功能,例如,流行病学调查显示,牙齿缺失是导致阿尔兹海默病的一个危险因素,该病在空间记忆和工作记忆中均伴随着海马神经元的丢失。因此研究磨牙缺失影响学习记忆功能的作用途径有助于老年人加强对阿尔兹海默等有关学习记忆功能障碍疾病的预防和改善。
　　 目的:第一部分研究磨牙缺失对KM、SAMP8以及ICR小鼠学习记忆能力的影响,并探索其可能作用的机制,为临床预防老年性痴呆提供实验依据。第二部分研究长苞凹舌兰提取物CE对磨牙缺失导致ICR小鼠学习记忆能力减退的保护作用。
　　 方法:
　　 1、磨牙缺失动物模型的建立
　　 所有小鼠用10％水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉后,假手术组小鼠在左侧上牙槽嵴磨牙与尖牙间的无牙区用咬骨钳去除少量牙槽骨;磨牙缺失组拔除双侧上颌所有磨牙(术中尽量完整拔牙,若牙根折断,则去除龈上可见的牙体组织,消除咬合接触)。术后仍用常规颗粒饲料,自由饮水,观察小鼠一般情况及体重情况。
　　 2、水迷路实验
　　 水迷路装置是一个双层不透明的方形塑料盒(80cm×50cm×20cm),通过测定小鼠在游泳过程中进入盲端的错误次数和到达终点所花费的时间,判断其近记忆和空间学习记忆能力。
　　 3、旷场分析实验
　　 将小鼠依次放入准备好的RD1413鼠博士旷场分析仪中,预先适应环境2min,然后视频摄像记录小鼠自主活动的轨迹,采用系统自带的分析软件分析。
　　 4、高效液相色谱法
　　 水迷路实验结束后,所有KM小鼠快速断头取脑,分离皮层和下丘脑,分别测定单胺类和氨基酸类神经递质。
　　 5、蛋白质免疫印迹实验
　　 各组小鼠断头取脑分区(皮层、海马和脑干),称重,记录,迅速放入液氮中冷冻,用普利莱总蛋白提取试剂盒提取皮层和海马中总蛋白。考马斯亮蓝G-250法测定蛋白浓度。等量蛋白上样电泳,BDNF采用12％分离胶,TrkB采用10％的分离胶分离。然后,将分离的蛋白电转至PVDF膜上。用含5％脱脂奶粉的0.1％TBST溶液封闭非特异性结合,室温轻摇2hr,取膜加一抗4℃孵育过夜。将膜用0.1％TBST漂洗三次,每次10min,然后取膜加二抗室温孵育2hr,0.1％TBST漂洗三次,每次10min,加ECL超敏发光液,用Fuji Digital Science成像仪显影,应用图像分析GelproAnalyzer(version4.0)测量显影条带的IOD值。
　　 6、HE染色
　　 为了便于进行神经病理观察,每组选三只动物,用含4％多聚甲醛的PBS(pH7.4)溶液灌注固定,之后用石蜡包埋,切取4μm厚石蜡切片,用苏木精-伊红进行染色观察。
　　 7、免疫组化
　　 迷路实验结束后,所有动物采用10％水合氯醛麻醉(400mg/kg),用0.1M磷酸盐缓冲溶液配制的4％多聚甲醛灌注,然后后固定24h,用石蜡包埋,采用显微切片机按照标准流程切取4μm厚脑片,脑片先用PBS冲洗,后用30％H2O2室温孵育10min灭活内源性酶,之后5％BSA室温封闭20min,接着4℃过夜孵育BDNF和TrkB一抗,按照1:100稀释,后用PBS冲洗两分钟,冲洗三次,然后37℃孵育抗兔的二抗20min,DAB显色之前滴加ABC试剂37℃孵育20min,PBS洗2min洗3次。镜下观察显色,后用蒸馏水冲洗,最后冲洗完按照标准操作透明,显微镜下观察。
　　 结果:
　　 1、KM、SAMP8和ICR小鼠手术后体重变化
　　 手术前,各组动物体重一致,手术后,连续观察一周体重发现各组体重均有所降低,然而与假手术或对照组相比,磨牙缺失组下降更加明显,手术后一周,各组小鼠体重逐渐恢复到手术前水平。
　　 2、水迷路实验
　　 本实验中,KM和SAMP8小鼠手术后每月进行一次水迷路实验,结果显示,在磨牙缺失后一个月,KM和SAMP8小鼠均未表现出学习记忆方面的差别,然而,手术后三个月,SAMP8和ICR小鼠磨牙缺失组表现出明显的学习记忆能力下降,与假手术组相比P＜0.05,KM小鼠在磨牙缺失后两个月,其游泳潜伏期与假手术组相比明显延长,以上实验结果表明,磨牙缺失后小鼠的学习记忆功能明显受到损伤。
　　 3、旷场实验
　　 我们在KM和SAMP8小鼠上的研究结果显示,磨牙缺失后小鼠的自主活动能力与其对照组相比没有明显变化。
　　 4、高效液相色谱法法
　　 磨牙缺失后小鼠大脑皮层内DA和5-HT的含量与假手术组相比明显降低,5-HIAA的含量升高,同时DOPAC/DA升高39.8％,5-HIAA/5-HT升高29.7％,以上变化P＜0.05。磨牙缺失后小鼠下丘脑内NA、5-HIAA和HVA的含量与假手术组相比升高,且P＜0.05。氨基酸类递质检测结果显示:磨牙缺失后小鼠皮层及下丘脑中谷氨酸的含量显著降低,P＜0.05,谷氨酰胺的含量略有变化,但无明显差异,而GABA的含量基本无变化。
　　 5、蛋白免疫印迹实验
　　 我们分别对KM、SAMP8和ICR小鼠皮层、海马以及脑干中BDNF及其受体TrkB的表达进行测定。结果显示,KM小鼠磨牙缺失后两月,皮层中BDNF的表达明显下降(P＜0.05 vs.sham),然而皮层中TrkB、CREB以及Bcl-2的表达均无变化。SAMP8小鼠在磨牙缺失后三个月检测发现,皮层(P＜0.01 vs.sham)以及海马(P＜0.05 vs.sham)中BDNF的表达均显著下降,而其受体TrkB检测表达并未下降。ICR小鼠在磨牙缺失后三个月检测发现,皮层(P＜0.01 vs.contro)、海马(P＜0.05 vs.contro)以及脑干(P＜0.05 vs.contro)中BDNF的表达均显著下降,且其受体TrkB在皮层中的表达也有显著降低(P＜0.01 vs.contro),但在海马和脑干中的检测未发现同样结果。与DM组相比,低剂量给药(DML)组脑干中BDNF的表达明显增加,高剂量给药(DMH)组皮层中BDNF的表达明显增加,中剂量给药(DMM)组皮层和脑干中BDNF表达均增加,同时皮层中TrkB表达也明显增加。
　　 6、HE染色
　　 HE染色结果显示,海马CA3区细胞排列不规则,紊乱,细胞数量减少,胞体皱缩,胞浆嗜酸性变,可见胞核固缩,而同时,杏仁核后皮质也观察到明显的细胞数减少,胞浆嗜酸性变。而当给予不同剂量CE后,均能不同程度改善以上病变。
　　 7、免疫组化
　　 免疫组化皮层部分结果显示,单双侧磨牙缺失后,皮层中BDNF的表达均显著下降,且P＜0.01;TrkB检测结果显示,双侧磨牙缺失后皮层中TrkB的表达明显降低,且P＜0.01。海马(P＜0.05)、杏仁核后皮层(P＜0.05)和三叉神经脊束核(P＜0.05)免疫组化结果显示,双侧磨牙缺失后,BDNF的表达明显下降,而以上脑区单侧磨牙缺失组并无变化。与DM组相比,DML组皮层和三叉神经脊束核中BDNF阳性表达细胞数显著增加,DMH组皮层、杏仁核后皮质以及三叉神经脊束核中BDNF阳性细胞数也均表达增加。DMM组增加最为明显,皮层、杏仁核后皮质以及三叉神经脊束核中BDNF阳性细胞数显著增加,且皮层中TrkB的表达也有显著增加。
　　 结论:磨牙缺失导致小鼠咀嚼功能下降,从而使咀嚼活动通过三叉神经上传到三叉神经脊束核的活动减少,三叉神经脊束核通过脑干网状结构投射到皮层的活动性刺激减低,最终导致皮层、海马、三叉神经脊束核和杏仁核后皮层区域BDNF活性依赖性表达下降,其受体TrkB在皮层中的表达也活性依赖性降低,从而导致BDNF-TrkB共同维持的神经元兴奋性活动与抑制性活动失衡,引起下游通路一系列反应,从而最终引起学习记忆能力下降的。化合物CE能同时增加三叉神经脊束核以及皮层及其相关组织中BDNF的表达,同时增加皮层中TrkB的表达,从而重新启动BDNF-TrkB信号通路,发挥其对磨牙缺失后小鼠学习记忆能力的保护作用。

目录

文摘

英文文摘

磨牙缺失对KM、SAMP8和ICR小鼠学习记忆能力的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

长苞凹舌兰提取物CE对磨牙缺失后小鼠学习记忆能力的改善

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述 简述BDNF在学习记忆中的作用

致谢

个人简历